科尔松弛频率作为识别肺组织中癌症的参数:初步动物和离体患者研究

简介

背景

肺癌占全球所有癌症相关死亡的20%，是全球最常见的癌症诊断，占所有癌症诊断的13%。据估计，全球每年有200万例肺癌病例，170万人死亡[1］．肺癌的经济健康负担估计占世界国内生产总值的1.5%，约1.2万亿美元[2］．

肺癌的诊断始于使用胸部x光片和低剂量计算机断层扫描(CT)技术检测肺结节或肿块。每500次胸部x光片中就有1次会出现结节和/或肿块，只有约40%为癌变[3.］．这些结节通常发生在肺深部周围，需要通过分支气道结构才能到达。区分良性和恶性肺结节的非手术金标准技术是经胸穿刺活检或支气管镜活检[4］．这些技术的诊断准确率分别低于78%和60%，但对较小结节的敏感性降低[4，5］．因此，当发现小结节(<1厘米)时，通常监测3 - 6个月，并在生长时进行随访。更先进的技术能够在肺恶性小结节中准确地发现癌症，有助于实现早期诊断和及时治疗，这对肺癌的生存至关重要。近年来，低剂量CT筛查被证明可以通过将癌症检测从症状性晚期癌症转移到早期癌症来降低肺癌死亡率，这得到了国家肺部筛查试验和NELSON试验的支持[6］．癌性结节5年后的相对存活率约为50%，如果首次诊断为直径为1厘米或以下的结节，则可上升至80% [3.］．在这篇论文中，作者提出了一种新的技术，结节扫描，通过对组织的电评估提供癌性肺结节的准确诊断。通过将新技术获得的结果(癌性与非癌性)与3种不同组织的病理报告结果进行比较，可以测试结节扫描的准确性:(1)来自30名患者的人类肺肿瘤(体外人类肺测试);(2) A549人肺肿瘤异种移植物，生长在小鼠模型和来自同一小鼠模型的非癌肺组织上，在体内测试，包括灌注的影响，以及体外(动物试验);(3)健康通风的猪肺，插入A549癌性结节，以包括呼吸的影响并证明检测敏感性(猪肺试验)。我们假设结节扫描可以区分癌性和非癌性，就像之前在乳房和皮肤中显示的那样[7-9］．

NoduleScan技术

生物阻抗建模用于癌症检测

组织的生物电学特性的表征通常使用电路模型来实现，该模型试图用电学术语描述细胞外和细胞内介质以及跨细胞膜的离子运动的频率依赖行为，以及膜极化效应。Cole-Cole阻抗模型(图1)常用于描述生物组织的阻抗行为[10］．

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在这种表示中，恒相元件(CPE)是一个经验电路元件，纯粹用来描述由于系统不均匀性而导致的极化现象:

在哪里C_α为伪电容，α为其阶数(0<α<1)。

Cole-Cole方程(2)在原理上源于CPE模型，特别是当描述生物组织的阻抗行为为时

在哪里τ= 1/2πf_c是松弛常数，C_α=τ^α/ (R₀- r_∞)，而且f_c为科尔弛豫频率(CRF) [11］．

基本参数(R₀，R_∞,f_c)可用于描述和表征组织的生物阻抗行为。虽然这些参数不一定描述阻抗测量中涉及的物理机制，但在文献中，R₀而且R_∞与细胞外介质和液体有关，而α和C_α具有膜极化和离子渗透性[12-14］．因此，我们发现只有CRF可能足以在频率范围为10的范围内区分癌性组织和非癌性组织^3.Hz ~ 10⁷Hz，通常被称为β色散区，在这里细胞膜具有最强的频率响应[8］．细胞膜在β区域的这种增强的弥散敏感性可能会从生理学上解释为什么在给定组织中健康细胞和癌细胞之间的膜极化和离子渗透性差异会导致不同的阻抗特征，特别是CRF值[15］．

最近，一项373例患者的队列研究表明，CRF这一单一参数可用于检测乳腺癌，敏感性和特异性分别为95%和87% [8］．同样，CRF已被用于识别皮肤癌，敏感性和特异性分别为100%和90% [7，9］．以同样的方式，基于β频率范围内的阻抗谱，CFR参数将在本研究中用作肺癌检测的生物标志物[15］．

用于测试的防毒墙网络版设备

CRF测量使用四极电极系统获得，如图所示图2．4个电极通过电镀铂黑(PtBlk)制备，其结果是非极化电极表面，适用于组织的生物阻抗测量。电解凝胶[16]用于在电极和组织之间提供电耦合。当与组织接触时，在β频率区域以离散频率(每十年32次)记录频谱阻抗测量。在这种四极结构中，两个外部电极是刺激电极，通过施加1V电流驱动电流通过组织_rms电压，而两个内电极用于测量电压差。然后根据电压差与电流的比值计算出复杂生物电阻抗的幅值和相位。对β频率区域内的每个离散频率重复进行阻抗测量。我们的测试设备经过优化，在2x10中具有最高保真度^3.Hz-1x10⁷Hz频率范围。

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阻抗数据分析

原始阻抗数据通过以下步骤进行分析。

1. 去除来自探头和电缆中无功电路元件的寄生电阻-电容伪影。
2. 奈奎斯特路径分析的数据，初步确定癌症
3. 求α和f_c使式(1)中的阻抗公式与数据之间的相关性最高的值。
   • 如果CRF值(f_c)在10的范围内⁵Hz-2.1 x 10⁶赫兹(定义为癌变范围)[8)，则该扫描被定性为“癌症”，否则“没有癌症”。
   • 如果没有CRF值(f_c)，则仅根据奈奎斯特路径分析结果，将扫描定性为“无癌”。
4. 通常情况下，对每个样本在稍有不同的位置进行多次扫描。如果至少有一次扫描是癌症，那么该样本就被定性为“癌症”。否则，如果一个样本的所有扫描结果都是“没有癌症”，那么该样本的特征就是“没有癌症”。

作为应用结节扫描技术的一个例子，图3显示从小鼠模型获得的两个标本计算的复阻抗的虚分量。图中显示了去除寄生电容分量后测量阻抗的虚分量。图3A为生长在小鼠身上的A549肿瘤的阻抗响应，经病理证实为“癌症”。对于这个样本，我们的扫描检测到大约6x10的清晰峰值⁵Hz，将其归类为“癌症”。图3B为取自同一只小鼠的健康肺样本的阻抗响应，经病理证实为“无癌”。对于这个样本，在癌症范围内没有检测到任何峰值;因此，该样本被归类为“无癌症”。图4中相同数据集的Nyquist路径图图3对于1x10的癌症频率范围内的数据点⁵-2.1 x10⁶赫兹。癌症扫描呈凹拱形，如Cole函数所示(方程1，是步骤2中癌症/非癌症初始分类的基础)。

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方法

人体肺离体检测

患者(n=30)经知情同意，在WCG IRB的批准下，从合作伙伴威斯康星州密尔沃基的Aurora St. Luke医疗中心招募(研究编号:1264221)。研究对象从Aurora医疗系统内任何部位的非小细胞肺癌(NSCLC)患者中招募，这些患者被诊断为肿瘤大小为>1.4 cm，并被选择进行手术楔形节段切除术或肺叶切除术，包括或不包括淋巴结清扫。

• 研究人口:诊断为NSCLC的成年男性和女性，适合楔形切除术或解剖切除术，或胸椎淋巴结清扫术。
• 入选标准:年龄在18岁或以上，活检证实为肺癌，并计划行楔形切除术或解剖切除术的成年男女患者。术前诊断为非小细胞肺癌，可能包括:浸润性癌、鳞状细胞癌或腺癌，对于那些计划手术切除组织的患者。
• 排除标准:拒绝对其切除组织进行研究的患者，诊断为小细胞肺癌的患者，诊断为非小细胞肺癌并接受化疗或放疗诱导治疗的患者，以及不适合手术切除的患者。

研究对象术前经外科医生和Aurora研究协调员同意。然后，患者按照护理标准进行肺叶切除术或节段切除术，并将其切除。作者与病理工作人员合作，从每个患者的两个部位选择组织:一块来自疑似癌变区域，一块来自距离疑似癌变部位至少5厘米的非癌变组织。通过将电极放置在每个组织样本的不同位置(肿瘤和远离肿瘤)进行CRF测量。谱阻抗扫描完成后(对肿瘤和离瘤切片进行多次扫描)，组织样本将返回给病理人员进行立即处理和组织学评估。

动物实验

概述

有了人离体肺评估的令人鼓舞的结果，我们继续回答有关在灌注组织中区分癌症和非癌症的能力的问题。20只小鼠接种了NSCLC细胞系，所有小鼠都存活到肿瘤完全生长。通过活体动物的皮肤对肿瘤进行CRF测量，在对动物实施安乐死后暴露肿瘤，随后，将肿瘤本身切除并测量。这些结果与取自同一只小鼠的切除的健康肺组织的测量结果进行了比较。

bag Albino近交系裸鼠BALB/c NU/NU (n=25)植入培养的肿瘤细胞(A549个肺肉瘤细胞，来自美国类型培养收藏，ATCC: CCL-185)。这些A549细胞(2 × 106个细胞在大约100 μ L无菌PBS中)皮下注射到每只小鼠的右侧。

肿瘤大小在0.1厘米之间的动物^3.到1.0厘米^3.均用于本研究。肿瘤测量每周监测两次，直至终止。肿瘤大小计算公式:体积=½长x宽²．

动物实验在伊利诺伊大学(UIC)毒理学研究实验室(TRL)进行。该研究方案得到了UIC动物保护和机构生物安全办公室的批准(批准号:20-147)。

谱阻抗测量

1. 活体小鼠皮肤完好时肿瘤的阻抗测量:在活体小鼠肿瘤部位完整皮肤表面测量CRF。活老鼠被它们的颈后和尾巴固定住，并在肿瘤部位测量电极的位置。测试完成后，对小鼠实施安乐死。
2. 肿瘤暴露的死小鼠的阻抗测量:从小鼠的后端切下一个皮瓣，向前方延伸，直到整个肿瘤都能接触到，从而暴露肿瘤部位。然后将测量电极直接放置在暴露的肿瘤上，记录多次频谱阻抗扫描。
3. 体外肿瘤阻抗测量:将肿瘤从动物体内全部切除并对半切开。然后将肿瘤片的切片面逐个放置在测量电极上，对每片进行频谱阻抗扫描。其中一块送组织学检查。
4. 非癌切除小鼠肺阻抗测量:从动物身上切除肺(非癌变组织)并切片，使内部面暴露出来。记录频谱阻抗测量扫描。其中一块送组织学检查。

猪肺测试

概述

两只健康的猪肺在安乐死后24至26小时内被接收，气管和声带完好无损，并在4°C的恒温下连夜运往研究机构。声带被切除，一个手动呼吸机被连接并牢牢固定。使用呼吸机对肺进行充气和放气，并使用压力表测量施加的压力。

另外，5个人肺肿瘤(A549细胞系)按照前面讨论的鼠异种移植癌方法在5只单独的小鼠中生长。小鼠接种肿瘤后，定期监测肿瘤大小。一旦肿瘤大小超过500mm^3.时，对小鼠实施安乐死，切除肿瘤并将其一分为二。因此，每个等分片的尺寸大于250毫米^3.平均而言，准备插入猪肺组织，以便在模拟呼吸期间进行光谱测量。

谱阻抗测量

1. 体外肿瘤阻抗测量:在切除和平分后立即记录A549肿瘤的频谱阻抗测量。测量是在离体的肿瘤内对半表面进行的。其中一个切片放入10%的福尔马林中，送到组织学实验室进行评估。
2. 健康猪肺组织阻抗测量:当猪肺放气时，对猪肺进行谱阻抗测量。随后将肺加压至20mmhg，并保持充气状态，保持恒压。最后，缓慢释放空气，以<1 mmHg / s的速度放气肺。在放气过程中，进行了多次谱阻抗扫描。
3. 猪肺内肿瘤的阻抗测量在肺上建立一个皮瓣，通过切割肺最外层的胸膜层来暴露下表面的肺组织。皮瓣组织被切成与先前从小鼠身上切除的A549肿瘤大小相匹配的宽度，以确保肿瘤适合肺下表面。用卡尺测量并记录皮瓣厚度;目标切口组织厚度<300微米。剖开的A549肿瘤放置于创建的肺下表面，皮瓣覆盖肿瘤。测量肿瘤位置的肺表面，肺处于充气和放气状态。对每个肿瘤样本重复此步骤。在研究过程中，每15分钟向肺部涂抹一次生理盐水，以保持组织水化。

结果

人体肺部测试结果

患者的人口学和肿瘤特征在表1．

肿瘤最大尺寸为7.5 cm。根据方案，肿瘤大小大于1.4厘米的受试者被纳入研究。肿瘤的平均大小为3.22 cm，中位大小为3.0 cm，标准差为1.47 cm。图5上图显示了由病理决定的癌性肿瘤样本的CRF值的直方图。底部图显示病理学家确定为健康组织的CRF测量值。注意，每个样本需要多次扫描。当存在癌症扫描时，样本被归类为“癌症”，低于阈值的扫描被忽略。直方图中的数据点表示测量CRF值的对数平均值。

癌区CRF值(1x10⁵hz - 2.1 x10⁶Hz)与癌组织的病理报告进行比较。一个肿瘤样本(经病理证实为“癌症”)没有在癌症频率范围内产生CRF值，导致假阴性。我们发现三个“正常”组织标本(经病理证实为“无癌”)的CRF值在癌变范围内，且距离肿瘤病灶至少5厘米，导致假阳性。总体敏感性和特异性值(联合肿瘤和远端肿瘤组织)分别为97%和87%。阳性预测值为88%，阴性预测值为96%。研究结果总结于表2．

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小鼠模型试验

• 肿瘤的生长:接种后，每只小鼠定时测量肿瘤高度和直径。最终肿瘤大小平均为432毫米^3.标准偏差为222毫米^3.．
• 活体小鼠皮肤完好时肿瘤的阻抗测量:从病理报告中确认为肿瘤的所有样本都在癌症范围内检测到CRF峰值。CRF中位值确定为3.11x10⁵赫兹。在一些样本中，可以观察到多个不同的CRF峰值——这一现象在之前的文献中报道过[8］．在肿瘤样本中，我们通常在较高频率范围内观察到原发性CRF，在癌性范围内观察到次级CRF值，在较低频率范围内观察到次级CRF值。这些次级CRF值对应于非癌组织。非癌性CRF测量和癌性CRF测量的存在反映了肺癌的异质性[17］．
• 肿瘤暴露的死小鼠的阻抗测量:在暴露肿瘤的不同部位记录阻抗测量。CRF中位值确定为4.36x10⁵赫兹。
• 切除肿瘤的阻抗测量:切片肿瘤的测量值与暴露肿瘤的测量值相似。切片肿瘤的中位CRF值为8.32x10⁵赫兹。所有的组织学数据都证实了组织碎片是癌变的。这提供了肿瘤和非肿瘤病例的CRF曲线的直接比较。肿瘤切片和肺切片的CRF频率直方图的比较图6在下面。横轴表示频率(Hz)值以10为底的对数。直方图使用活小鼠、暴露的肿瘤、提取的肿瘤和提取的肺(健康组织)的CRF值形成。一般情况下，对每个样品进行3-4次扫描。当存在癌症扫描时，样本被归类为“癌症”，低于阈值的扫描被忽略。直方图中的数据点表示测量CRF值的对数平均值。

分析表明，所有肺切片(无肿瘤样本)的CRF测量值均低于1x10的决策阈值⁵Hz, CRF频率中位数为9.68x10^3.赫兹。另一方面，大多数肿瘤切片样本的CRF峰值高于决策阈值，CRF频率的中位数为8.28x10⁵赫兹。

在表3，我们展示了肿瘤样本与CRF扫描的病理学结果的比较，以及健康肺组织与CRF测量的比较。分析的10个样本，结果对应于100%的敏感性，100%的特异性，100%的阳性预测值和阴性预测值。

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猪肺测试

模拟呼吸对CRF值的影响

为了了解模拟呼吸的影响，在图7，我们比较了放气、充气和模拟呼吸病例的直方图。数据包括皮下(皮瓣上电极)和皮下(肿瘤上电极)合并病例。没有测量到的CRF峰值被归类为非癌症。在模拟呼吸场景(放气/充气/期间)中，CRF峰值频率的对数平均值发生了变化，并且在0.05 log周期内。在无癌范围内，CRF测量量较少，导致直方图图中信息有限。

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讨论

主要研究结果

我们开始测试一种新的技术，结节escan，通过对组织的电评估来诊断癌性肺结节。此外，我们已经证明癌组织和非癌组织的诊断与乳房组织和皮肤组织的诊断是一致的。7-9］．

我们已经证明，切除的人肺癌结节的体外CRF测量可以区分癌性和非癌性肿瘤，敏感性为97%，特异性为87%。

在异种移植小鼠模型中，发现肿瘤生长与已发表的文献中接种等量A549细胞的小鼠一致[18］．在小鼠体内生长的A549肺肉瘤在CRF值上表现出与离体肺组织以及先前报道的乳房和皮肤组织相同的区别。当在体内通过皮肤测量时，测量结果保持相同，皮肤打开肿瘤暴露并切除肿瘤。肿瘤灌注或未灌注时，CRF测量值无差异。当病理检查确认为癌变的肿瘤测量值与牺牲小鼠的健康肺组织进行比较时，敏感性和特异性为100%。

CRF分布的清晰分离，如图6，表明CRF是一个可行的参数，以确定癌症的存在。癌症诊断是通过对同一组织样本进行多次扫描来完成的。对于每一个低于阈值的初级峰值，至少有一个来自同一组织的其他扫描显示出癌症范围CRF频率，因此正确地将样本分类为“癌症”。

在模拟呼吸过程中，可以检测到CRF值并保持相对不变。CRF值与离体人类肿瘤试验、异种移植小鼠以及先前证实的乳房和皮肤组织所显示的范围相同。

结论

关注的患者

表2显示可疑病变的病理评估为非癌变，其次，正常组织评估为癌变。患者为6036号患者，一名60岁女性，正在行右上肺叶切除术;研究患者6086号患者，一名72岁女性，正在行右下肺叶切除术。6036号患者所见结节未显示癌变范围内的CRF值，随后病理检查证实为纤维化组织，TNM状态ypT0, pN0，未检出癌变，与扫描结果一致。6086号患者在远离肿瘤的组织(> 5cm)测量了癌性范围内的CRF值，病理检查证实边界为阳性，因此与我们的测量结果一致。

NoduleScan技术

快速完成结节扫描评估(几秒钟即可完成一次完整扫描)。这可以在没有昂贵或笨重的资本设备的情况下完成。此外，学习解释CRF测量，而医生确实需要解释，是直接的，不像解释共聚焦显微镜测量那样主观。

作为评估清晰边缘的手术工具

肺癌手术治疗的目的是切除边缘清晰的恶性肿瘤，即癌细胞不存在于被切除组织的分裂边缘[19］．适当的切缘宽度的定义大致为2厘米或与肿瘤直径相同。阳性边缘(癌细胞出现在切除组织的切边)会导致癌症复发的发生率增加，这一原则已被广泛接受。“阳性”切缘在某种意义上是残余肿瘤的替代品，这些患者已被证明有增加的局部复发和死亡风险[19-21］．

边缘的病理学评估包括从切除标本的所有切割面取样组织边缘。病理学家用显微镜检查标本的整个边缘是不现实的。该技术允许将电极嵌入到手持或机器人手术工具上，允许外科医生在手术室中快速有效地评估边缘。在切缘阳性的情况下，可实施辅助治疗，以帮助消除局部残留疾病[20.］．肿瘤的显微阳性(R1)与边缘被肿瘤严重累及的肿瘤(R2)的分类可能会受到标本的这种即时分析的影响[20.，22-27］．

作为收集高效活组织检查的工具

据报道，ct引导下穿刺活检的非诊断率为27.6%。小于1cm的结节未诊断率为40% [28］．四分之一的活组织检查效率低下，使患者面临并发症和风险。该系统中的电极可以小型化，可以安装在支气管镜的2mm孔内或活检针的表面。如果能够有一种设备，无需直接对组织进行采样，就可以给出恶性肿瘤的指示，这将使这一过程的产量大大提高，因为一些非诊断性样本也可能带有CRF，表明结节是恶性的。电极可以间隔以评估结节的整体，从而补偿结节的非均匀性。这种测量可以为癌症的存在提供准确、实时的答案。以前难以从气道实时定位的病变现在可以很容易地定位，因为该技术可以从气道进行宏观可视化，并识别癌性和良性结节。这提供了一个精确的围术期病变内评估机制，以确认病变内癌细胞的位置。

淋巴结评估

淋巴结状态通常会影响先进行手术或诱导化疗(N2淋巴结)的决定。此外，N3淋巴结将影响是否需要手术切除的决定。这些淋巴结既可以在计划切除前通过纵隔镜检查，也可以在计划切除中但在切除本身发生之前进行评估。实时节点评估消除了时间和资源密集的冻结病理分析过程及其固有的不确定性，在这些情况下将是无价的。

残余肿瘤

在某些情况下，患者接受诱导化疗和/或放射治疗，然后进行手术切除。这涉及5%到10%的肺癌患者，但食管癌患者的比例要大得多。有时他们的术前诱导治疗会导致完全病理应答(CPR)，在这种情况下，通过病理评估没有发现存活的肿瘤。在这一患者群体中测量CRF可能会对这一评估产生重大影响。在CPR的设置中，CRF阳性可能会对该指定提出质疑，并对复发风险有一些影响。同样，在接受明确放化疗的患者中，如果他们不是手术候选人，并且正在接受治疗后监测，评估CRF治疗区域的能力可能会导致更早地发现复发。此外，如果局部内镜切除边缘不确定，这可能是有价值的。