我们基于多组学和TCGA ( 表1)，通过Broad GDAC Firebrowse获取[ 23]及GDC数据门户[ 24- 26］．我们使用了三级RNAseq (RNA测序)、miRNAseq (microRNA测序)和甲基化阵列数据。排除标准:0值大于10%的基因(当缺失数据量大于10%时，结果可能有偏差)[ 27]、总体生存信息(生存时间或状态)不足的患者、TCGA中存在配对的正常组织和转移样本的患者。

临床变量(肿瘤分期、年龄、性别、癌症类型、母细胞数、组织学分级、侧度、解剖肿瘤细分、肿瘤组织部位和人乳头瘤病毒状态)可以根据癌症的种类包括在网络中，以便进行复杂的分析。当有两个类别时(例如，化疗:否或是)，临床变量被分类为0和1，当临床变量可以分为三个或更多类别时(例如，侧性:右、左或双侧)，使用虚拟变量。

ESurv使用以下三种方法之一:最小绝对收缩和选择算子(套索)、弹性网正则化(弹性网)和网络正则化高维cox -回归(net)，使用R [ 2， 10， 12， 14］．在网络分析中，我们使用r中的石墨包(3.10版本)将大型数据库(KEGG[京都基因与基因组百科全书]、Biocarta、HumanCyc、Reactome、Panther和NCI[国家癌症研究所])的拓扑路径信息转换为基因网络矩阵。用户可以设置混合参数alpha，该参数决定套索回归和山脊回归之间的平衡[ 10， 14］．所有分组变量的选择都使用10倍交叉验证。变量选择后，通过变量值乘以回归系数计算预后评分。

为了确定最佳截止值，防止过度优化，我们使用了最大UNO的c指数和5倍交叉验证。对于Kaplan-Meier生存曲线，根据特定的基因表达参数(中位截止值或最佳截止值)将患者分为高危组和低危组 P由log-rank测试确定的值。用c指数和曲线下面积(area under The curve, AUC)值来评价特定变量对生存率的影响[ 28］．这些结果不仅在所有患者中可见，而且在基于性别或分期的患者亚组中也可见。使用R包生存(版本2.44-1.1)、survMisc(版本0.5.5)、coin(版本1.3-0)、MASS(现代应用统计学与S，版本7.3-51.4)、edgeR(版本3.24.3)和survAUC(版本1.0-5)获得结果。ESurv的所有图形输出都使用plotly(4.9.0版本)R包绘制。本研究中所有数据清理和统计分析均使用R统计软件(版本为3.6.0,R Core Team, R Foundation for statistical Computing)进行。

ESurv web服务器通过HTML5实现AngularJS，通过web查询界面显示分析数据。这些分析的结果在后台服务器上按需计算，后台服务器运行Java Servlet并结合R统计程序。

ESurv的运行程序的细节描述在 图1．首先，用户可以从三种方法中选择一种:单变量生存分析、分组变量选择或用户服务。

在选择单变量生存分析后，用户可以选择单基因分析或全基因组log-rank检验。在单基因分析中，用户按此顺序选择癌症类型、基因数据类型(mRNA、microRNA [miRNA]或甲基化)、感兴趣的基因和接收者工作特征(ROC)曲线的时间。对于整个基因组的log-rank测试，用户选择癌症类型、基因数据类型(mRNA、miRNA或甲基化)、ROC曲线的时间和 P值阈值，按此顺序。

如果用户选择分组变量选择，他们必须选择癌症类型、基因数据(mRNA、miRNA、甲基化或综合分析)、分组变量选择方法(套索、弹性网或net)、ROC曲线的时间和alpha，按此顺序。Alpha决定了脊和套索惩罚之间的平衡;alpha越大，越接近lasso (alpha=1)，选择的变量越少。如果用户选择Net，他们可以在分组变量选择中包含临床变量。

在用户服务中，用户可以在上传自己的数据后执行单变量或分组变量选择。上传数据的详细说明在手册中。一旦上传了数据，就可以进行上述所有的分析。

最后，当使用选定的变量开发基因签名时，用户应该依次为ROC曲线选择癌症类型、感兴趣的基因和时间。

ESurv确定了在包括性别和癌症分期(由美国癌症联合委员会定义的早期和晚期)在内的各个亚组中，单基因作为分类(带有中值或最佳截止值的Kaplan-Meier曲线)或连续变量(特定时间点的c指数和AUC值)的预后意义。为了补充分类变量的结果，将c指数和AUC值作为连续变量计算。例如，我们使用mRNA ( SLC2A1)作为膀胱尿路上皮癌的生物标志物(n=403; 图2)．如 图2A和B，在所有患者中，最佳截止值的鉴别能力远优于使用中值截止值完成的分析。用户很容易获得亚组以及所有患者的生存曲线。在时间相关的ROC曲线分析中，用户可以根据随访时间识别AUC值( 图2C).选定时间的ROC曲线均可计算( 图2D)。

如果用户想要计算特定癌症中所有基因变异的预后价值，他们可以选择对整个基因组进行log-rank测试。在这里，我们对结肠腺癌的全基因组进行了log-rank测试 P< . 05。ESurv提供了结果(基因名称、c指数、用户选择时间的AUC值、 Plog-rank test的值)作为Excel文件( 多媒体附件1)．

分组变量选择方法已被开发出来，以利用生物技术的进步，并可用于统计模型，以准确预测患者的预后[ 2， 10］．为了从高维数据中选择预后基因集，有必要以系统的和统计上可靠的方式选择和最小化变量的数量。ESurv提供了具有代表性的分组变量选择方法(lasso, elastic net, net)，通过考虑变量之间的关系来减少变量的数量。为了开发一个风险评分系统，我们使用了所选变量的表达式值和回归系数的线性组合。用户可以使用这些选项的任意组合在泛癌中开发一个强大的预后特征。为了说明这一点，我们使用肝细胞癌的所有临床变量(n=307; 图3)．选择的变量和回归系数可以从ESurv的摘要选项卡下载为Excel文件。所有可能的亚组的结果都被记录下来，就像单基因分析的情况一样。分析的输出可以是Kaplan-Meier曲线、时间相关的ROC曲线和特定时间点的AUC值( 图3)．

用户可以通过上传自己的数据( 图1C).手册载于 多媒体附件2而且 3.．如前所述，用户可以使用自己的数据集生成所有存活结果。为了保护数据完整性，用户派生的数据集受密码保护，并连接到唯一的用户ID。此外，当用户细化他们的需求时，他们可以通过电子邮件请求额外的生存分析包。要求最多的软件包将在第二年加入ESurv。

为了克服现有生存分析工具的局限性，我们开发了一个基于web的用户友好的工具，称为ESurv。Kaplan-Meier曲线是医学领域进行生存分析的常用方法，它涉及根据患者的风险情况将患者分组。在这些分类分析方法中，没有明确的标准来分类连续变量，如基因表达。因此，在以前的工具中使用的中位数和四分位截止值可能会忽略单个基因的预后意义。如 图2B，中值截止点不是风险分层的合适参数，而最优截止点是风险分层的良好参数。此外，生存分析作为一个连续变量应该伴随着这些结果来评估相关基因的预后意义。研究人员可以确定一个基因(mRNA, miRNA和甲基化)作为ESurv的分类和连续变量的预后意义。

多基因预后优于单基因预后。选择基因签名的方法有很多，但在这些方法中，使用分组变量选择选择的基因被证明是最通用和可复制的[ 2， 5， 9， 10， 13， 29， 30.］．分组变量选择方法在考虑多重共线性的同时，从高维数据集中选择和缩小变量，这在考虑生物途径时尤其有价值，使Net选项非常适合这些应用。尽管如此，分组变量选择还没有应用到许多研究中，因为其计算机编程(R, Python和Matlab)的困难。为了解决这一差距，我们在ESurv中添加了分组变量选择方法(套索、弹性网和net)。当从高维数据中选择预后基因集时，研究人员必须尽量减少变量的数量。为了有效地减少变量，我们必须提供尽可能多的连接基因及其相关途径的信息[ 2， 10］．使用Net比使用其他方法更容易完成外部验证，因为它使用关于每个基因的信息来执行变量选择，这些信息来自与遗传途径相关的数据库(Reactome、HumanCyc、KEGG、Biocarta、NCI和Panther) [ 2， 10， 29， 30.］．与单变量分析一样，用户可以获得连续和分类数据的结果。ESurv是第一个使用多组学数据提供分组变量选择的基于web的工具。

患者的预后可能因性别、分期等临床信息的不同而有所不同[ 9， 31- 35］．由于这些原因，需要亚组分析来确定分期和性别特异性的预后基因。ESurv显示了基于多种分类(癌症类型、分期和性别)考虑肿瘤异质性的生存分析结果。

这个软件确实有一些局限性，将在进一步的开发中加以解决。这里我们只使用了一个癌症数据库，但是还有很多，我们计划在继续开发软件的过程中将这些数据库添加到ESurv中。虽然用户可以上传自己的数据，但这仍然需要用户精通计算机;这将在软件的未来版本中解决。此外，ESurv目前只访问癌症数据库，但这种类型的分析在其他疾病中很有价值，包括几种血管和退行性疾病;我们的目标是添加这些。最后，ESurv的分析并不是穷尽无遗的，但是用户可以通过电子邮件为R请求额外的生存分析包。然后，我们将选择要求最多的包，并将其添加到ESurv每年的基础上。

ESurv提供的最重要的功能是，用户可以使用该软件分析自己的数据。随着越来越多的医学数据的产生，对生存分析的需求也在增加。对个别机构创建的数据进行分析与大数据分析同样重要，但目前还没有能够进行这种分析的生存分析工具。ESurv使用先进的统计方法和全面的生存分析，克服了以往工具的局限性，允许用户使用自己的数据集。我们坚信ESurv是一种理想的工具，可以满足在小型和大型数据集中日益增长的生存分析需求。