SARS-CoV-2新变种的不断演变对各个部门的人员，特别是卫生保健和诊断、预防和治疗开发领域的研发人员，以及政策制定者和管理人员，都是一个重大挑战。该病毒于2019年12月在中国首次被发现，后来传播到全球各地，引发了大流行。然而，病毒基因组的持续突变在全球不同地理区域的流行病毒中产生了几个新的变体。这些突变导致患者的传播性、抗体逃避和严重程度增加。多项研究指出，冠状病毒的刺突蛋白负责与人体细胞相互作用，并渗透到细胞内部[ 1， 2];然而，在负责刺突蛋白的基因中积累的适应性突变已经允许病毒适应并逃脱宿主的免疫系统。在世界范围内已经分离和确定了许多变种;世界卫生组织将其分类为关注的变种(alpha、beta、gamma、delta和omicron)和感兴趣的变种(VOIs;Eta, iota, kappa和lambda) [ 3.］．

基因的单一突变可导致蛋白质中一个氨基酸的变化，从而在许多方面极大地影响生物体的能力，如遗传性、快速适应性、躲避宿主免疫系统的稳定性和致病性[ 4］．在过去十年中，新一代测序等高通量第二代测序技术的出现，有助于及时对SARS-CoV-2变体的基因组进行测序，以识别新基因变体之间发生的突变。快速测序技术不仅促进了病毒基因组测序，还有助于加快COVID-19诊断工具、疫苗和治疗方法的开发。此外，基因组序列数据和数据库的可用性有助于科学界通过对病毒的分子、生化、基因组和蛋白质组分析来了解该病毒。然而，新冠病毒的不断进化迫使科学界不断努力，对病毒变异的特性有新的和彻底的了解，并制定对抗病毒的策略，以保护人类。

蛋白质的等电点(pI)对于决定蛋白质的物理化学性质至关重要[ 5］．蛋白质表面的带电氨基酸暴露于溶剂、水合作用和脱水也会影响蛋白质的pI [ 6， 7］．因此，评估野生型和突变变体的刺突蛋白的pI对于了解刺突蛋白对病毒行为和病毒传播率的影响以及开发预防和治疗药物是非常重要的。此外，翻译后修饰、磷酸化、甲基化和烷基化也会影响蛋白质的pI，这是不可忽视的。同样，新冠病毒的基因组在适应人类宿主的微环境时，也容易发生遗传进化或遗传转移。这种突变会导致新的变异的出现，这些变异可能与它的祖先菌株相比具有不同的特征。因此，本研究拟采用计算机分析方法，对野生型和其他变体SARS-CoV-2的刺突蛋白序列进行分析，了解其物理化学、功能和进化特性，通过系统了解其不断进化的特性，有助于对SARS-CoV-2进行监测，并开发诊断工具和标准化的预防和治疗策略。

目前由SARS-CoV-2引起的COVID-19大流行已经清楚地表明，冠状病毒有可能在野外不断进化，并以不同的物理化学和毒性特性传播给包括人类在内的新物种。世界上已经出现了这种病毒的几种变种，“VOIs”和“关切变种”夺走了数百万人的生命。然而，由于从2021年初开始疫苗的供应，情况似乎得到了控制。然而，了解病毒不断变异的特性，建立有效和及时的卫生保健策略，以避免由此造成的经济损失或负担，保护人类，这是最重要的。对于卫生保健和科学界以及政策制定者和管理人员来说，了解SARS-CoV-2等威胁生命的生物是一个持续而具有挑战性的过程。研究和了解致病因子有几种方法，近年来，硅内分析方法通过减少所需的工作量、时间和成本，极大地简化了科学界的工作。因此，在这项研究中，我们努力了解关注点的变体，特别是它们的刺突蛋白是如何在全球范围内传播的。对SARS-CoV-2野生型和突变型的刺突蛋白的理化性质分析，揭示了delta型的有趣特征，如pI、分子量、不稳定性指数、GRAVY和脂肪指数( 表2)．

蛋白质的pI值对于理解其生化功能至关重要[ 23]并且依赖于可电离氨基酸基团的解离性和常数。SARS-CoV-2中存在的主要可电离氨基酸为精氨酸、天冬氨酸、组氨酸、谷氨酸、半胱氨酸和赖氨酸，这些氨基酸在确定刺突蛋白的pI中起重要作用[ 24- 26］．然而，翻译后修饰会影响蛋白质的pI。δ型中P681R的突变[ 22]将一种氨基酸从组氨酸转变为精氨酸，这激发了我们的好奇心，试图了解氨基酸变化对α和δ变体刺突蛋白特性的潜在影响。有趣的是，两种氨基酸的pKa值差异很大——组氨酸的值为6.0(低碱性)，精氨酸的值为12.5(高碱性)。在delta变异中观察到的其他特定突变本质上也是基本的或脂肪族的( 表1)．因此，如果这种性质是实质性的，那么这将使蛋白质更碱性。alpha变异中的P681H突变并未引起病毒行为的实质性变化，但delta变异中的P681R突变确实在病毒的传播性、致病性、免疫逃避和感染的严重程度方面引起了病毒行为的实质性变化[ 22］．相反，在D614G变异刺突蛋白中观察到中性突变[ 27， 28]，其中一个酸性氨基酸(D)被中性氨基酸(G)取代。

为了观察pI对生物化学性质的影响，通过预测2D凝胶参考图来评估野生型和变异刺突蛋白，有趣的是，除了地图上的delta蛋白分离外，该参考图显示了分组( 图2)．物理化学性质和二维凝胶分析的结果表明，蛋白质的pI在蛋白质的行为中起着重要的作用，特别是当高pI使蛋白质变得更加阳性或脂肪族。此外，有趣的是，蛋白质的这种特性被用于抗体制备，使蛋白质或其亚基更具免疫原性[ 29， 30.］．因此，我们认为在设计和制备预防和治疗药物时，应该考虑到蛋白质的这一特性。同样，最近一项对SARS-CoV-2病毒颗粒的VOIs的研究发现，与野生型相比，VOIs具有更低的表面电荷和疏水性，这可能是VOIs具有更强的传播能力的原因[ 29］．因此，蛋白质的pI和病毒颗粒的表面电荷和疏水性是设计任何病毒性疾病的预防和治疗方法时需要考虑的重要因素[ 4， 28， 30.， 31］．

尚未观察到野生型SARS-CoV-2及其变体的刺突蛋白的物理化学性质发生实质性变化;然而，在beta变异中观察到大量的磷酸化位点(136个)，而在delta变异中观察到少量的磷酸化位点(130个)。同时，在gamma变异中观察到大量的n -糖基化位点(20个)，而在delta变异中观察到少量的n -糖基化位点(16个)。野生型和变异型的二硫键总数变化不大;然而，它的范围在14到15之间，而且键的数量足以保证结构的稳定性。总的来说，物理化学性质没有显著差异;然而，所发现的差异足以影响蛋白质行为的变化，进而影响病毒的行为。

野生型SARS-CoV-2及其变异株的抗原性和免疫原性评分有趣，尤其是delta变异株的评分分别为高、低。比较pI、抗原性和免疫原性，评价数据的意义;的 Pα变异与野生型之间的值为0.007，δ变异与野生型之间的值为0.02，δ变异与α变异之间的值为0.02。总的来说,这些 P结果表明，预测值和抗原及免疫原序列是可靠的。与野生型和其他变体相比，delta变体中暴露的b细胞和细胞毒性t淋巴细胞表位数量较低。暴露的delta变异b细胞表位序列为SLGAENSVAYSN，表位序列的变化表明突变确实对病毒形态有影响。

利用蛋白质序列构建系统发育树，评价了野生型及其变异之间的进化关系。有趣的是，我们发现了D614G、beta和gamma变体的清晰分组，beta和gamma的引导值为100%，而D614G和beta/gamma的引导值为93%。δ型变异接近 Rousettus蝙蝠冠状病毒及中东呼吸综合征冠状病毒( 图3)，自举值为68%。阿尔法变异与野生型接近，自举值为83%。有趣的是，我们可以观察到delta变异在野生型和MERS-CoV之间的杂交位置 Rousettus蝙蝠冠状病毒。因此，我们认为delta变种可能携带野生型和其他野生蝙蝠冠状病毒的特征( 图3)．在另一个有趣的观察中，omicron变体似乎是从引导值为99%的D614G变体进化而来的，并且从beta和gamma变体中引入了一些特征，因为omicron也被看到从这两个引导值为60%的变体中分支出来( 图3)．

总之，我们的研究强调了SARS-CoV-2中适应性突变的积累影响了刺突蛋白pI的变化，进而影响了病毒的行为。通过对野生型及其变异株穗蛋白理化性质的预测和比较，发现与野生型相比，delta变异株穗蛋白发生了独特的变化。进化特征显示了野生型、α和δ刺突蛋白的清晰分离，以及D614G、β和γ刺突蛋白的分组。然而，新的SARS-CoV-2毒株的不断进化需要进一步系统地了解其变体，这不仅有助于开发临时快速“抗原检测”市场，而且有助于开发疫苗和治疗方法。因此，更多类似的研究将揭示病毒的重要生化特性、进化历史、免疫行为和生理特性。