发表在第三卷第1号(2022):1 - 12月

本文的预印本(早期版本)可在以下网站获得https://preprints.www.mybigtv.com/preprint/36100,首次出版
SARS-CoV-2多表位疫苗的研制:免疫信息学研究

SARS-CoV-2多表位疫苗的研制:免疫信息学研究

SARS-CoV-2多表位疫苗的研制:免疫信息学研究

原始论文

1伊朗德黑兰Shahid Beheshti大学生命科学和生物技术学院生物技术系

2伊朗巴斯德研究所新技术研究组纳米生物技术部,伊朗德黑兰

3.德黑兰医学大学内分泌与代谢临床科学研究所内分泌与代谢研究中心,伊朗德黑兰

4新西兰奥塔哥大学微生物与免疫学学系

5伊朗德黑兰医学大学消化疾病研究所消化疾病研究中心

6伊朗德黑兰医科大学医学院免疫学系

7伊朗德黑兰医学大学内分泌和代谢临床科学研究所个性化医疗研究中心,德黑兰

通讯作者:

瓦希德·哈帕纳,医学博士,公共卫生硕士,博士

内分泌与代谢研究中心

内分泌代谢临床科学研究所

德黑兰医科大学

Shariati医生医院

北卡尔加大道

德黑兰14114年

伊朗

电话:98 21 88220037

电子邮件:v.haghpanah@gmail.com


背景:自2019年12月新冠病毒首次在中国出现以来,世界见证了新冠病毒的爆发。由于该病毒的高传播率,迫切需要设计和开发针对SARS-CoV-2的疫苗,以防止更多的病例受病毒影响。

摘要目的:提出了一种计算方法来设计针对SARS-CoV-2刺突蛋白(S)和包膜蛋白(E)的疫苗,后者是中和抗体的关键靶点,具有保守的序列特征。

方法:我们使用先前报道的S蛋白表位进行实验检测,并进一步鉴定了一系列预测的b细胞和主要组织相容性(MHC) ii类限制t细胞表位,这些表位来源于与SARS-CoV-2 E蛋白完全匹配的E蛋白。

结果:我们对SARS-CoV-2的S和E蛋白候选疫苗的硅芯片设计显示了对MHC II类分子的高亲和力,并在免疫反应模拟中取得了有效的结果。

结论:基于本研究结果,针对SARS-CoV-2的S和E蛋白设计的多表位疫苗可能是一种安全、有效的抗击COVID-19大流行的新方法。

JMIR Bioinform Biotech 2022;3(1):e36100

doi: 10.2196/36100

关键字



最近在中国武汉市爆发的这种新病毒有助于发现一种新的冠状病毒毒株,称为SARS-CoV-2,属于冠状病毒科。这种病毒造成了严重损害和焦虑,导致无数人死亡,迄今影响了535 86 3950多人。SARS-CoV-2导致了名为COVID-19的疾病,在需要住院的个人中,这种疾病与流感样疾病、急性呼吸窘迫综合征以及肺炎的临床或放射学证据等症状相关[1].据报道,确诊为COVID-19的患者白细胞介素(IL)1β、干扰素(IFN)γ、干扰素诱导蛋白10 (IP10)和单核细胞趋化蛋白1 (MCP1)水平较高,可能导致T助手-1细胞应答激活。相比之下,需要进入重症监护病房的患者粒细胞集落刺激因子IP10、MCP1、MIP1A和肿瘤坏死因子-α的浓度高于非重症监护病房的患者,提示细胞因子风暴和疾病强度可能存在相关性。尽管如此,SARS-CoV-2感染也导致T辅助2细胞细胞因子(如IL4和IL10)的生成增强,它们抑制不同于SARS-CoV感染诱导的炎症[2].SARS-CoV-2感染的持续上升和高感染率说明迫切需要开发安全有效的疫苗。

疫苗大多由完整的病原体组成,要么被消灭,要么被减毒。然而,使用能够产生针对特定病原体的免疫反应的蛋白质疫苗可能是有益的。基于表位的疫苗利用免疫原性蛋白(表位)诱导免疫应答。EV的性能是通过作为基础的表位的数量来计算的。然而,候选表位的实验鉴定在时间和金钱方面都是昂贵的。此外,抗原表位的最终选择需要考虑不同的免疫学要求[3.].

冠状病毒的性质可以用电子显微镜测定。冠状病毒是带有单链阳性RNA的包膜病毒。冠状病毒基因组大小从26 kb到32 kb不等[4].像所有的冠状病毒一样,SARS-CoV-2由四种病毒蛋白质组成,分别是刺突蛋白(S),一种糖蛋白;膜(M)蛋白,覆盖膜;包膜(E)蛋白,一种覆盖整个冠状病毒结构的强疏水蛋白;核衣壳(N)蛋白,一种抑制RNA干扰以克服宿主防御反应的结构蛋白[56) (图1A).这种辅助蛋白不仅是病毒粒子组装所必需的,而且还可能在扰乱宿主免疫反应以促进病毒复制方面发挥额外作用[7].SARS-CoV-2需要S糖蛋白作为中和抗体的关键靶点与受体结合,促进膜融合和病毒进入。每个三聚体S蛋白单体的大小约为180 kDa,由S1和S2两个亚基分别介导结合和膜融合[8].因此,S蛋白,而不是其他结构蛋白,是引起防御性中和抗体产生的主要抗原,这种抗体阻止病毒附着在其特定受体上,从而防止病毒感染[910].S和M结构蛋白也被证明有大量的突变修饰,而E和N结构蛋白则高度保守(图1A),表明在进化过程中对SARS-CoV-2施加的不同选择压力[11].E蛋白是一种小的固有膜蛋白,积极参与病毒生命周期的几个阶段,如组装、繁殖、包膜和发病[12].这种蛋白质还通过调节钙的浓度来减缓蛋白质在分泌通路中的运输2 +和H+在高尔基体和内质网间室中,这被认为是一种免疫回避机制[13].

在本研究中,我们从蛋白质数据库中收集了S和E蛋白序列,并使用各种生物信息学工具进行分析,以确定保护表位。分析了全E蛋白作为第二抗原的毒性,并鉴定了毒性表位。预测的b细胞和主要组织相容性复合体(MHC) ii类限制性t细胞表位与这些区域不一致。与S蛋白相比,E蛋白中毒性更小的表位的存在是设计针对这两种抗原的有效疫苗的动机。

特别是,我们试图设计一种针对两种结构抗原S和E蛋白的疫苗,而不使用内置佐剂,以获得一种可以有效对抗SARS-CoV-2当前和潜在突变的疫苗,同时具有低分子量的优势,以避免未来制造的复杂性。由于E蛋白具有较高的保守性,并且候选疫苗在不使用佐剂的情况下,在模拟中显示了所有预期的特性,因此研究目标实现了。

图1。SARS-CoV-2多表位疫苗开发的总体研究设计示意图。(A)针对SARS-CoV-2包膜(E)蛋白的多表位疫苗硅胶内设计的研究流程。(B) 21个选择的表位的重叠合并显示最终的结构由8个表位组成。HLA:人白细胞抗原;国家生物技术信息中心。
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蛋白质序列检索

基于vaxquery数据库[14],选择SARS-CoV-2的S和E蛋白作为疫苗设计的靶点,因为已经有基于这些蛋白的疫苗在开发或生产中。SARS-CoV-2的E和S蛋白氨基酸序列收集自美国国家生物技术信息中心(NCBI)病毒数据库[15],注册号分别为QHD43418和QHR63280。

b细胞表位预测

预测方法既省时又经济,是预测线性b细胞表位的可靠方法,作为在病原生物中识别b细胞抗原的全基因组探索的第一步[16].ABCpred数据库[17包括用于预测线性b细胞表位的全长E蛋白序列。在本研究中,我们将“threshold”设置为0.51(默认值),“length”设置为16(默认值),“overlap filter”设置为NO。ABCpred使用一种机器学习方法,需要固定长度的模式进行训练或研究,b细胞表位长度从5到30个残基不等。为了克服这个问题,服务器试图通过删除残基或将残基链接到终端,从b细胞表位创建固定长度模式的数据集。由于只有一个隐含层,ABCpred服务器采用了部分循环神经网络(Jordan网络)。该网络包含一个具有35个残基的隐藏层,可选择的窗口长度为10、12、14、16、18和20。结果是1或0(表位或非表位)的单个二进制值。

使用三个参数评估预测算法的性能[1718]:敏感性、特异性和准确性。灵敏度计算为表位被正确识别为表位的百分比,公式为(TP/[TP+FN])×100,其中TP和FN分别为真阳性和假阴性的数量。特异性计算为正确预测非表位的百分比,公式为(TN/[TN+FP])×100,其中TN和FP分别为真阴性和假阳性的数量。准确性的计算方法是,正确预测的总次数(包括TP和TN)除以预测的总次数,再乘以100。

免疫表位数据库[19]浏览了现有的对SARS-CoV-2 S蛋白的实验性b细胞测定方法。IEDB记录了在人类、非人灵长类动物和其他动物物种中检测的抗体和t细胞表位的实验证据,包括感染性疾病、过敏、自身免疫和移植。我们使用以下参数浏览S表位:“表位”设置为“线性肽”,“有机体”设置为“SARS-CoV”,“抗原”设置为“刺突糖蛋白”,“化验”设置为“T细胞”和“B细胞”,“MHC限制”设置为“II类”,“宿主”设置为“人类”。

对于使用IEDB进行E蛋白的b细胞表位预测,我们使用了Bepipred线性表位预测2.0服务,该服务基于随机森林算法训练表位和从报道的晶体结构中获得的非表位氨基酸,从蛋白质序列中预测b细胞表位,然后进行顺序预测平滑[20.].

t细胞表位预测

t细胞表位是一组可被t细胞受体检测到的蛋白质,在给定的抗原被细胞内加工并附着在至少一个MHC分子上,然后在抗原呈递细胞(APCs)表面作为MHC蛋白复合体表达。对于至少有一个MHC分子与过敏原的致敏氨基酸序列具有强亲和力的实体,能够检测到该MHC蛋白复合体的t细胞克隆在遗传上容易对该过敏原产生过敏反应。可以利用先进的统计和数学方法在二氧化硅中研究这一概念[21].E蛋白辅助T淋巴细胞(HTL)表位由IEDB数据库预测[19].IEDB对t细胞MHC II类表位的预测,“预测方法”设置为“IEDB推荐2.22”,“物种/位点”设置为“人类”/“HLA-DRA-DBR1*01:01”和“HLA-DPB1*01:02”,“长度”保持默认设置。IEDB推荐使用共识方法,该方法比较了多种预测MHC II类表位的方法,包括结合了NN-align、SMM-align和组合文库方法的共识方法[19].IEDB上可用的另一个工具可以根据相关抗原通过库浏览实验性HTL表位[19].

抗原性、致敏性和毒性预测

使用阈值为0.4的VaxiJen v2.0预测b细胞和t细胞表位的抗原性。VaxiJen是第一个与校准无关的抗原预测服务器,它的开发是为了实现抗原的分类,仅基于蛋白质的物理化学性质,而不求助于序列校准。该系统可以单独使用,也可以与基于校准的预测方法结合使用[22].该服务器的方法基于z描述子、自交叉协方差(ACC)预处理、偏最小二乘判别分析和训练集的序列相似性[23].z描述子反映了抗原识别最关键的理化特征,包括描述蛋白质序列的z1、z2和z3描述子。氨基酸的疏水性用第一主成分(z1)表示,大小用第二主成分(z2)表示,极性用第三主成分(z3)表示。自协方差Ajj(滞后)由式(1)表示[22]:

(1)

使用索引计算z刻度jj= 1,2,3),n(序列中氨基酸的数量),(氨基酸位置;=1, 2,…n),和l(滞后)(lL = 1,2,……)。采用小范围的滞后(L=1,2,3,4,5)来探讨氨基酸近距离性对蛋白质抗原性的影响。两个不同z尺度之间的交叉协方差Cjk(滞后),j而且k,由式(2)计算:

(2)

使用VaxiJen v2.0评估全蛋白嵌合体的抗原性。基于该服务器,最终蛋白的抗原性评分为0.5830 (probably ANTIGEN),阈值为0.4。同样,ANTIGENpro [24]被用来预测蛋白质嵌合体的抗原性。ANTIGENpro是一种无校准、基于序列和病原体无关的蛋白质抗原性预测器。ANTIGENpro是蛋白质抗原性的第一个指标,经过训练,可以使用五种病原体的蛋白质微阵列分析的反应性数据。

使用AllerTOP v2.0预测b细胞和HTL抗原表位的致敏性。蛋白质序列以简单文本的形式发送到该服务器。结果页面然后提供过敏原的标识为“可能的过敏原”或“可能的非过敏原”。使用该工具预测全蛋白嵌合体为“可能的非过敏原”[20.].选择该服务器是因为与其他类似服务器相比,它在预测过敏原性方面的灵敏度高(94%),预测准确率高(94%-100%)[20.].与VaxiJen类似,该数据库通过z描述子和ACC转换分析蛋白质序列的表示[1718].

ToxinPred [25],其蛋白质片段长度为10,用于预测b细胞和HTL表位的毒性。毒素pred是一个计算工具,用来预测和设计有毒和无毒的蛋白质。该方法使用的主要数据集由1805个有毒蛋白质(≤35个残基)组成。该服务器也被用于预测全蛋白嵌合体的毒性,没有片段被预测为毒素。

嵌合蛋白的构建

选择b细胞和HTL表位构建蛋白嵌合体作为多表位疫苗。重叠的b细胞和HTL表位被合并。Bilysine (KK)连接子作为柔性连接子被用于连接表位。KK连接子被植入到不同的表位之间,以维持它们独立的免疫功能(图1B). KK是组织蛋白酶B的靶序列,组织蛋白酶B是MHC II类抗原呈递中必不可少的抗原处理蛋白酶之一[26].

氨基酸组成、理化性质和溶解度预测

Protparam数据库[27]用于计算和预测分子量、等电点(pI)、体内和体外半衰期、失稳指数II和亲水性大平均值(GRAVY)。来自ExPASy服务器的ProtParam是一个计算物理化学性质的可靠算法。然而,它通过接口使用单个序列进行每次分析。采用权重值计算失稳指数,如式(3)[28]:

(3)

其中L为序列长度,DIWV(x[] x [+1])为起始位置的二肽的不稳定性权重值.不稳定指数小于40的蛋白质被认为是稳定的,而指数大于40的蛋白质被认为是不稳定的。

脂肪族侧链(丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸和亮氨酸)所占的相对体积被称为脂肪族指数,它被认为是增强球状蛋白热稳定性的潜在有益元素。脂肪族指数由公式X(Ala)+计算一个X (Val) +b(X (Ile) + X(低浓缩铀))(29],其中X(Ala)、X(Val)、X(Ile)和X(Leu)分别表示丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸和亮氨酸的摩尔百分比(100×mole分数)和系数一个而且b缬氨酸侧链的相对体积(一个=2.9)和Leu/Ile侧链(b=3.9)到丙氨酸侧链上。

来自ANTIGENpro的SOLpro程序[24]用于预测蛋白嵌合体在过表达时的溶解度。SOLpro预测蛋白质在过表达时的可溶性倾向大肠杆菌使用基于主序列多重表示的两阶段支持向量机模型。

PepCalc服务器[30.]被用来预测最终蛋白质的溶解度,这只提供了一个非常粗略的水溶性估计。

二级结构预测

Prabi服务器[31]用于预测蛋白质嵌合体最终序列的二级结构。PRABI的所有组成部分都在各自的专业领域提供服务(例如,分子、系统发育、基因组学、转录组学、蛋白质组学、蛋白质结构和医学生物统计学)。选择“GOR IV”作为二级结构预测方法。程序输出两个文件:一个是序列和按行排列的预期二级结构(H=螺旋,E=延伸或β链,C=线圈),另一个是每个氨基酸位置上每个二级结构的概率值(H=螺旋,E=延伸或β链,C=线圈)[32].

PSIPRED 4.0 [33]服务器也被用来预测二级结构,它提供了更多的残基构型的细节。这是一个非常简单的二次预测系统,基于对psi - blast生成的剖面的简单神经网络评估,能够生成将该过程置于预测系统作物最顶端的结果[33].

最终疫苗表位与MHC分子的分子对接

来自RPBS Web门户服务器的PEP-FOLD 2.0 [32]用于预测疫苗构建表位的三级结构。PEP-FOLD是一个在线工具,旨在为长度为9-25个氨基酸的蛋白质在水溶液中的三维蛋白质构象结构建模(从头建模)。PEP-FOLD从一个氨基酸序列开始进行了50个系列模拟,并返回发现的最关键能量和种群相关构象[32].

ClusPro 2.0服务器[3435]将疫苗蛋白的每个最终表位的配体旋转7万次。配体旋转相对于MHC受体等位基因在网格上的三个轴(x, y, z)上翻译。从7万次旋转中选出前1000个能量最低的停靠结构,然后依次进行处理。这个集合可能至少包含一些接近该综合体的原生结构的模型。然后,服务器通过查找在9 Å接口均方根偏差半径内具有最多“邻居”的结构来对1000个旋转进行聚类。这个配体和它的邻居分别被认为是“簇中心”和簇的“成员”。其余的配体重复这一过程,以寻找下一个簇。最后,服务器为模型提供评分,并根据集群大小(10个人口最多的集群)报告得分最高的模型[3435].ClusPro 2.0作为自动化蛋白质对接服务器的主要优势之一是它能够高精度地生成蛋白质-蛋白质复合物[36].

使用PyMOL软件对对接结果进行分析。PyMOL主要用于晶体学、分子动力学模拟和蛋白质建模软件包的分子可视化[37].

免疫反应模拟

通过IL4pred服务器预测最终疫苗结构中的8个表位中的IL4-、IL10-和ifn γ诱导蛋白[38, IL-10Pred服务器[39, IFNepitope服务器[40),分别。

使用C-ImmSim 10.1服务器模拟疫苗注射的免疫反应[41].C-ImmSim 10.1是一种基于代理的计算免疫反应模拟器,它分别利用位置特定的评分矩阵和机器学习方法来预测表位和免疫相互作用[42].我们根据预测的主要人类白细胞抗原(HLA)等位基因来调节参数。MHC I类的宿主HLA选择参数设置为A1010、A1101、B0702;DR MHC II类参数设置为DBR1_0101;注入时间步长分别设置为1、84和100(最大允许值)。我们使用Stothard随机打乱了疫苗蛋白序列(没有佐剂)P2000来自序列操作套件服务器[43,创建一个对照组。该免疫系统模拟服务器评估了与其氨基酸序列相关的通用蛋白质序列的整体免疫原性[41].整个模拟主要集中在三个事件上,(1)b细胞表位结合,(2)HLA I类和II类表位结合,(3)t细胞受体结合,在这三个事件中应该存在HLA -蛋白复合物的相互作用。这些过程是由细胞通过各种药剂和消耗特定的模拟生物量独立进行的[41].


蛋白质序列的选择

新冠病毒E蛋白和S蛋白氨基酸序列收集于2020年1月13日发布的NCBI病毒库,登录号分别为QHD43418和QHR63280,具有核苷酸完整性。FASTA序列用于构建抗SARS-CoV-2的多表位疫苗。

b细胞表位分析

ABCpred数据库回顾了线性b细胞表位分析的全长E蛋白序列。在通过抗原性、致敏性和毒性三个筛选的结果中,选择两个表位(NVSLVKPSFYVYSRVK和YVYSRVKNLNSSRVPD)作为保护表位(表1).然后利用IEDB对b细胞线性表位进行研究,得到了37个经实验鉴定的S蛋白表位[44-54].相比之下,SARS-CoV-2没有E蛋白的实验性b细胞表位。

t细胞表位分析

用IEDB分析与E蛋白MHC II类分子结合的表位。由于该数据库中没有相应的实验表位,我们使用预测方法来识别E蛋白的t细胞表位,而我们使用已有的S蛋白的实验t细胞表位[55].同样的抗原性、致敏性和毒性三个过滤器被用于识别保护性抗原。从等位基因数量来看,MHC II类等位基因中,HLA- dra - dbr1 *01:01和HLA- dpb1 *01:02为优势等位基因。

潜在表位的抗原性

b细胞和t细胞表位的抗原性均采用VaxiJen 2.0进行预测,阈值为0.4。抗原性评分高于阈值的预测表位被认为是“抗原”表位。其他两种筛选(致敏性和毒性)没有对“非抗原”表位(表1而且表2).

表1。预测了SARS-CoV-2包膜蛋白的t细胞和b细胞表位。一个
抗原决定基 b细胞 MHCb2 抗原性 变应原性 毒性
ABCpred

未选择用于疫苗构建


TLAILTALRLCAYCCN +c - - - - - -d 抗原 Nonallergen 毒素


LCAYCCNIVNVSLVKP + - - - - - - 抗原 Nonallergen 毒素


FVSEETGTLIVNSVLL + - - - - - - Nonantigen 停止 停止

入选疫苗构建


NVSLVKPSFYVYSRVK + - - - - - - 抗原 Nonallergen Nontoxin


YVYSRVKNLNSSRVPD + + 抗原 Nonallergen Nontoxin
IEDBe

未选择用于疫苗构建


IVNSVLLFLAFVVFL - - - - - - + 抗原 过敏原 停止


EETGTLIVNSVLLFL - - - - - - + 抗原 过敏原 停止


GTLIVNSVLLFLAFV - - - - - - + Nonantigen 停止 停止


IVNSVLLFLAFVVFL - - - - - - + Nonantigen 停止 停止


MYSFVSEETGTLIVN - - - - - - + Nonantigen 停止 停止


NIVNVSLVKPSFYVY - - - - - - + 抗原 过敏原 停止


RVKNLNSSRVPDLLV - - - - - - + 抗原 过敏原 停止


SEETGTLIVNSVLLF - - - - - - + Nonantigen 停止 停止


TGTLIVNSVLLFLAF - - - - - - + Nonantigen 停止 停止


YSFVSEETGTLIVNS - - - - - - + Nonantigen 停止 停止

入选疫苗构建


SFYVYSRVKNLNSSR - - - - - - + 抗原 Nonallergen Nontoxin


FYVYSRVKNLNSSRV - - - - - - + 抗原 Nonallergen Nontoxin


YVYSRVKNLNSSRVP - - - - - - + 抗原 Nonallergen Nontoxin


FLAFVVFLLVTLAIL - - - - - - + 抗原 Nonallergen Nontoxin


FVSEETGTLIVNSVL - - - - - - + 抗原 Nonallergen Nontoxin


KPSFYVYSRVKNLNS - - - - - - + 抗原 Nonallergen Nontoxin


YSRVKNLNSSRVPDL - - - - - - + 抗原 Nonallergen Nontoxin


NSVLLFLAFVVFLLV - - - - - - + 抗原 Nonallergen Nontoxin


VKPSFYVYSRVKNLN - - - - - - + 抗原 Nonallergen Nontoxin


VNSVLLFLAFVVFLL - - - - - - + 抗原 Nonallergen Nontoxin


VSLVKPSFYVYSRVK - - - - - - + 抗原 Nonallergen Nontoxin


VVFLLVTLAILTALR - - - - - - + 抗原 Nonallergen Nontoxin


LLFLAFVVFLLVTLA - - - - - - + 抗原 Nonallergen Nontoxin

一个根据等位基因数量确定t细胞表位为最佳表位。

bMHC:主要组织相容性复合体。

c+:相关的。

d-:无关。

e免疫表位数据库。

表2。来自免疫表位数据库的SARS-CoV-2刺突蛋白的实验t细胞和b细胞表位。
抗原决定基 入选疫苗构建 b细胞 MHC一个2 变应原性 毒性
AATKMSECVLGQSKRVD 没有 +b - - - - - -c 过敏原 停止
CKFDEDDSEPVLKGVKLHYT 是的 + - - - - - - Nonallergen Nontoxin
DDSEPVLKGVKLHYT 是的 + - - - - - - Nonallergen Nontoxin
DKYFKNHTSPDVDLGD 是的 + - - - - - - Nonallergen Nontoxin
DLGDISGINASVVNIQK 没有 + - - - - - - 过敏原 停止
EIDRLNEVAKNLNESLIDLQELGKYEQY 是的 + - - - - - - Nonallergen Nontoxin
EVAKNLNESLIDLQELG 没有 + - - - - - - 过敏原 停止
KNHTSPDVDLGDISGIN 没有 + - - - - - - 过敏原 停止
LYQDVNC 没有 + - - - - - - 过敏原 停止
LYQDVNCT 没有 + - - - - - - 过敏原 停止
MAYRFNGIGVTQNVLY 是的 + - - - - - - Nonallergen Nontoxin
MAYRFNGIGVTQNVLYE 是的 + - - - - - - Nonallergen Nontoxin
RASANLAATKMSECVLG 没有 + - - - - - - 过敏原 停止
SPDVDLGDISGINAS 没有 + - - - - - - 过敏原 停止
MAYRFNGIGVTQNVLY 是的 - - - - - - + Nonallergen Nontoxin
QLIRAAEIRASANLAATK 没有 - - - - - - + 过敏原 停止

一个MHC:主要组织相容性复合体。

b+:相关的。

c-:无关。

潜在表位的致敏性

b细胞和HTL抗原表位的致敏性由AllerTOP v. 2.0 (表1).

潜在表位的毒性

毒素pred预测b细胞和HTL表位的毒性,其蛋白片段长度为10 (表1而且2).

嵌合蛋白的构建

筛选出的表位被用于设计嵌合蛋白作为多表位疫苗。如表1而且2,我们筛选出21个表位(其中S蛋白的6个b细胞表位和1个HTL表位,E蛋白的2个b细胞表位和12个HTL表位),均满足“抗原”、“非过敏原”和“无毒素”的标准。为了在最后的构建中建立一个连续的序列,我们将b细胞和t细胞表位的重叠序列合并。其中MAYRFNGIGVTQNVLYE从S蛋白HTL表位MAYRFNGIGVTQNVLY、MAYRFNGIGVTQNVLY和MAYRFNGIGVTQNVLYE获得;CKFDEDDSEPVLKGVKLHYT来源于CKFDEDDSEPVLKGVKLHYT和DDSEPVLKGVKLHYT (S蛋白b细胞表位);SFYVYSRVKNLNSSRVPDL从yvysrvknlnssvpd (E蛋白b细胞表位)、sfyvysrvknknlnssr、YVYSRVKNLNSSRVP、ysrvknlnssvpdl (E蛋白HTL表位)获得;vnsvlflvvflvtlailtalr从vvflvtlailr、llflvvfllvtlailta、FLAFVVFLLVTLAIL、nsvlflvvfllv和vnsvlflvvfll (E蛋白HTL表位)获得;NVSLVKPSFYVYSRVKNLNS从NVSLVKPSFYVYSRVK (E蛋白b细胞表位)、vslvkpsfyvysrvvk、vkpsfyvysrknln和KPSFYVYSRVKNLNS (E蛋白HTL表位)中获得。预测的线性b细胞表位和t细胞表位使用KK连接体作为柔性连接器连接(图1B)。

最终疫苗结构中表位的排列对其半衰期和不稳定性等理化性质有很大影响,在哺乳动物细胞中,其半衰期从5.5小时到30小时不等,而稳定性仅通过改变表位的顺序即可从不稳定的蛋白质到完全稳定的蛋白质。因此,我们进一步研究了40多种可能排列的性质,考虑到所选表位的重叠,以找到该候选疫苗的最佳配方。

候选多表位疫苗的抗原性、致敏性和毒性估计

最终蛋白嵌合体的抗原性(图1B)由VaxiJen 2.0服务器估计为0.5830,阈值为0.4。利用ANTIGENpro平台对最终蛋白的抗原性进行了评估。基于这个服务器,整个蛋白质(图1B)预测为抗原,概率为0.415508。AllerTOP v.2.0服务器表明,最终的蛋白质被预测为“非过敏原”,而毒素pred服务器预测最终的蛋白质为“无毒”。

氨基酸组成、理化性质和溶解度预测

根据Protparam数据库,最终的蛋白质嵌合体包含173个氨基酸(图1B)分子量为19.9 kDa。pI值预测为9.57。据估计,在体外哺乳动物网织细胞中,其半衰期为30小时,在酵母中超过20小时,在体内超过10小时大肠杆菌体内。不稳定性指数II预计为26.45,将该蛋白归类为稳定蛋白(指数>40表示不稳定)。脂肪族指数为101.21,热稳定性高。估计的GRAVY值为-0.293。这一负属性表明该蛋白质是亲水性的,可以与水分子发生反应。此外,基于PepCalc服务器,预测其在水中的溶解度为“良好”。基于ANTIGENpro的SOLpro,预期该蛋白嵌合体是可溶的,概率为0.765767。

二级结构预测

最终蛋白质的二级结构(图1B)由Prabi服务器进行分析。最终的嵌合蛋白估计包括35.26%的alpha螺旋,20.81%的延伸链和43.93%的随机线圈(图2A). PSIPRED 4.0服务器预测的详细二级结构,包括残基及其构型,如所示图2B。

图2。最终疫苗候选蛋白的性质。(A) Prabi服务器预测的最终蛋白的二级结构。红色:拉长的线;蓝色:阿尔法螺旋结构;紫色:随机线圈。(B) PSIPRED 4.0服务器分析的残基及其排列。黄色和粉色区域分别表示链和螺旋;灰色连接器表示线圈配置。
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疫苗最终表位与MHC分子的分子对接

从PDB RCSB数据库(PDB ID分别为1AQD和3LQZ)中检索HLA-DRA-DBR1*01:01和HLA-DPB1*01:02的晶体结构。对PDB文件进行编辑并清除杂原子。使用来自RPBS网站门户服务器的PEP-FOLD 2.0分别预测疫苗结构的8个表位的三级结构。利用ClusPro 2.0在线服务器对抗原表位和整个疫苗构建与相关MHC等位基因进行分子对接。使用PyMOL软件对蛋白质-蛋白质相互作用界面进行详细分析(图3).最低能量停靠配合物的加权得分报告在表3.对模型进行排名的最佳方法是根据集群大小(成员的数量)[3435].以MAYRFNGIGVTQNVLYE和HLA-DPA1*01:03、DKYFKNHTSPDVDLGD和HLA-DPA1*01:03、CKFDEDDSEPVLKGVKLHYT和HLA-DPA1*01:03、EIDRLNEVAKNLNESLIDLQELGKYQY和HLA-DRB1*01:01的簇成员数量最多,分别为784、577、350和261个。

图3。分子对接分析。(A) VNSVLLFLAFVVFLLVTLAILTALR表位(绿色)和HLA-DPA1*01:03蛋白(蓝色)。(B) SFYVYSRVKNLNSSRVPDL表位(黄色)和HLA-DPA1*01:03蛋白(蓝色)。(C) MAYRFNGIGVTQNVLYE表位(红色)和HLA-DPA1*01:03蛋白(蓝色)。(D) NVSLVKPSFYVYSRVKNLNS表位(深蓝色)和HLA-DPA1*01:03蛋白(蓝色)。(E) FVSEETGTLIVNSVL表位(粉色)和HLA-DPA1*01:03蛋白(蓝色)。(F) vnssvllflafvvfllvtlailtalr表位(绿色)和HLA-DRB1*01:01蛋白(浅粉色)。(G) EIDRLNEVAKNLNESLIDLQELGKYQY表位(浅蓝色)和HLA-DRB1*01:01蛋白(浅粉色)。(H) NVSLVKPSFYVYSRVKNLNS表位(深蓝色)和HLA-DRB1*01:01蛋白(浅粉色)。 (I) MAYRFNGIGVTQNVLYE epitope (red) and HLA-DRB1*01:01 protein (light pink). HLA: human leukocyte antigen.
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表3。表位对接结果及免疫效应预测。
疫苗抗原表位 加权分数一个的复合码头与

HLAb-DPA1 * 01:03 HLA-DRB1 * 01:01 伊尔c4诱导物 IL10诱导物 干扰素dγ诱导物
MAYRFNGIGVTQNVLYE -869.2 -962.2 - - - - - -e - - - - - - - - - - - -
CKFDEDDSEPVLKGVKLHYT -758.7 -810.6 +f - - - - - - +
DKYFKNHTSPDVDLGD -763.2 -755年 + - - - - - - - - - - - -
EIDRLNEVAKNLNESLIDLQELGKYQY -715.4 -1050.7 - - - - - - + +
SFYVYSRVKNLNSSRVPDL -875.5 -992.2 + + +
FVSEETGTLIVNSVL -798.2 -823.9 + + - - - - - -
VNSVLLFLAFVVFLLVTLAILTALR -1148.3 -1477年 - - - - - - + +
NVSLVKPSFYVYSRVKNLNS -852.7 -1036.6 + + +

一个最低能量停靠结构的加权分数是基于人口最多的集群的集群大小。

bHLA:人白细胞抗原。

cIL:白介素。

d干扰素:干扰素。

e-:无关。

f+:相关的。

免疫反应模拟

我们分别通过IL4pred服务器、IL10pred服务器和IFNepitope服务器对最终疫苗构建中的6个表位中的IL4、IL10和IFNγ诱导蛋白进行了预测。结果显示在表3

C-ImmSim 10.1服务器刺激初级和次级免疫反应。该服务器模拟三次注射候选疫苗的免疫反应,时间步长分别为1、84和100;每个时间步等于8小时。为了进行相对比较,我们创建了候选疫苗的打乱序列作为对照蛋白,并分析了对对照蛋白注射的免疫反应模拟结果。这个打乱的序列被用来评估疫苗序列结果的重要性,因为在这个服务器的免疫反应模拟中,通过KK连接的最终表位的序列组成是一个重要的考虑因素。注射疫苗的结果明显不同于对照组的结果(图4而且图5).

图4。用C-ImmSim 10.1服务器模拟候选疫苗和对照蛋白的注射免疫反应。在时间步长为1、84和100的情况下进行了三次注射模拟;每个时间步等于8小时。(A) b细胞群。(B)每个州的B细胞数量。(C) T辅助(TH)细胞群。(D)每个状态的TH细胞数量。(E) T细胞毒(TC)细胞群。(F)每个状态的TC细胞数量。 (G) Macrophage (MA) cell population. (H) Natural killer (NK) cell population. (I) Immunoglobulins. (J) Cytokines. (K) Cytokines after the protein control injection. (L) Immunoglobulins following the protein control injection.
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图5。注射针对SARS-CoV-2刺突蛋白(S)和包膜蛋白(E)的候选疫苗后免疫反应模拟的图形表示。HTL:辅助性T淋巴细胞;BCL: b细胞淋巴瘤;IgM:免疫球蛋白M;IgG:免疫球蛋白G;IFN-γ: γ干扰素;2:白介素2;TCR: t细胞受体;MHC II类:主要组织相容性复合体II类; CD4: cluster of differentiation 4. The image was created using the Biorender illustrator tool.
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主要研究结果

ev为预防和治疗利用病原体特异性免疫提供了一种新策略[56].由一系列蛋白或重叠蛋白组成的多表位疫苗已被提出作为预防和治疗病毒感染的适当解决方案[57-62].完美的多表位疫苗应该包括能够激活细胞毒性T淋巴细胞、T细胞和b细胞的表位,并触发对特定病毒的成功应答[57].

我们在这里介绍了一种潜在的针对SARS-CoV-2的S和E蛋白的多表位疫苗的硅芯片设计,它包括b细胞和HTL表位,可以显著刺激免疫系统反应。针对特定有机体的多组分疫苗不太可能引起免疫干扰。对于多靶点疫苗接种,对一种免疫剂的强烈反应可减少对第二免疫原的边缘反应,从而使个人容易感染与第二免疫剂对应的病原体[63].由于SARS-CoV-2 S糖蛋白表面暴露,便于进入宿主细胞,因此它是中和抗感染抗体的主要优先任务,也是治疗和疫苗开发的目标[6465].S蛋白也是SARS-CoV和中东呼吸综合征(MERS)-CoV亚单位疫苗设计的主要重点[66].S三聚体广泛被n链聚糖包裹,这对高效折叠和调节对宿主蛋白酶的可及性和中和抗体至关重要[65-70].E蛋白在所有冠状病毒中都是保守的,覆盖了SARS-CoV-2的整个表面(图1A). E蛋白的毒性表位比S蛋白的毒性表位少。这一发现在文献中得到了证实,在2003年的SARS-CoV和最近的MERS-CoV中都发现了E蛋白,使用BioEdit Package工具证明该蛋白在7个菌株中保留,毒性区域比S蛋白更小[1257-62].有几项研究检查了E蛋白突变的冠状病毒的潜力,特别关注SARS和mers冠状病毒,它们是与希望结果相关的减毒活疫苗候选疫苗[1271-75].我们从NCBI数据库中获得了SARS-CoV-2 S和E蛋白的FASTA序列。E蛋白的b细胞表位和HTL表位是用不同的服务器预测的,而S蛋白的表位是用实验确定的。抗原表位的筛选基于抗原性、致敏性和毒性三个过滤器。因此,我们只选择了保护性表位。我们将b细胞和t细胞表位的重叠部分合并,并将它们与适当的柔性连接体融合。先前的研究报告称,当KK连接子插入表位之间时,它们能保持独立的免疫反应[26) (图1B)。

所提议的蛋白质嵌合体不具有致敏性,进一步增加了其作为候选疫苗的潜力[76].最后,对全蛋白嵌合体进行抗原性、致敏性和毒性分析,预测其作为抗原[22,非过敏原[20.,以及无毒[25].pI值为9.57,说明最终得到的蛋白是碱性的。疫苗蛋白结构在表达时被预测为“可溶性的”大肠杆菌宿主已知疫苗的结构稳定性是其有效性的一个重要方面,它可以确保抗原的适当呈递,从而有效激活免疫系统[7778].我们的候选蛋白的不稳定性指数II被计算为26.45,这表明该蛋白是“稳定的”。

二级结构分析预测最终蛋白由35.26%的α螺旋、20.81%的延伸链和43.93%的随机线圈组成。“结构抗原”的基本类型已被确定为原生折叠蛋白区和α螺旋线圈蛋白。当在合成蛋白质中检测这两种结构类型时,它们可以折叠成自身的结构,因此被感染反应中自然触发的抗体识别[7679].在结构疫苗学的背景下,需要一项分子对接研究来预测表位与抗体或MHC分子结晶片段的结合亲和力[8081].为了分析最终多表位疫苗对MHC分子的亲和力,我们对最终疫苗的8个表位与MHC II类受体进行了16次对接模拟。对接分析结果显著,表明疫苗结构的最终表位对MHC分子具有较高的亲和力。使用可视化工具进一步考虑了蛋白质-蛋白质相互作用的界面。

在设计多表位疫苗的下一步中,系统疫苗学方法有助于评估生物结构不同阶段的人类复杂免疫反应[82].最后,我们利用免疫模拟器服务器来预测免疫系统对三次候选疫苗的主要和次要反应。从细胞因子模拟图中,我们注意到IL-4和IFNγ水平的升高,这与黄等人报道的COVID-19患者的临床特征相似。2) (图4J). APCs的适当激活,b细胞和T细胞的广泛激活导致记忆细胞的大量产生,T辅助记忆细胞参与产生细胞因子从而控制和清除抗原,三次注射后明显的长期记忆持久性,这些都可以证实我们的候选疫苗的有效性[83].

最后,我们选择了一种分子量最低(序列长度最短)的多表位候选疫苗,这可能会导致低成本的制造和缩短生产时间[84].

与之前工作的比较

与COVID-19大流行期间建议的大多数多表位疫苗不同,我们更倾向于设计一种没有内置佐剂的疫苗。由于佐剂是通过防止蛋白质的快速降解来提高剂量效力所必需的[85,罐混合佐剂可以添加到最终配方中。例如,铝盐可以作为候选佐剂,因为它们被用于各种病毒和细菌疫苗,并有望提高抗原的稳定性[86].

佐剂在疫苗稳定性方面是有效的,可以有助于减少免疫和增强抗体反应。虽然我们建议的疫苗缺乏内建佐剂,但它显示出与以前报道的候选疫苗相同的稳定性和半衰期估计。与其他建议的多表位疫苗相比,我们的疫苗结构也显示出大致最高的AI,以及最高的热稳定性[29].只有在设计疫苗结构时精心安排所选的抗原表位,才能获得这些好处。因此,这项研究证明了测试疫苗性质中表位的各种排列的重要性。

最后,从内置佐剂中去除我们的多表位疫苗可以证明两次注射的免疫模拟(图4)诱导,因为设计的疫苗没有任何非特异性免疫佐剂的干扰。

结论

本研究的目的是提出一种预测SARS-CoV-2的保护性b细胞和t细胞表位的计算方法,并结合S蛋白的实验表位,构建针对该大流行疾病的嵌合蛋白候选疫苗。结果表明,该嵌合蛋白对免疫系统的MHC分子具有较高的亲和力,而这种新型疫苗注射后的免疫反应模拟结果证实了我们的发现。因此,这种利用免疫信息学方法设计的针对SARS-CoV-2的S和E蛋白的多表位疫苗可能被认为是一种新的、安全、有效的方法。

致谢

作者非常感谢Hajipour女士对手稿初稿的英文评论。

作者的贡献

FG、FN和VH提出了这项研究的概念。所有作者都进行了讨论和设计。FG完成了研究的所有部分。RAC监督生物信息学分析。FN监督免疫学实验。HS、AHRSM和MN有助于采集和数据分析。VH监督了整个项目。FG写了初稿,所有作者都严格审查并批准了最终版本的手稿。

利益冲突

没有宣布。

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ACC:自动交叉协方差
APC:抗原呈递细胞
E蛋白:包膜蛋白
电动汽车:表位疫苗
FN:假阴性
外交政策:假阳性
汤:大水溶平均
HLA:人白细胞抗原
HTL:辅助性T淋巴细胞
IEDB:免疫表位数据库
干扰素:干扰素
IL:白介素
IP10:干扰素诱导蛋白10
克鲁舍:bilysine
MCP1:单核细胞趋化蛋白1
即:中东呼吸综合征
MHC:主要组织相容性复合体
M蛋白:膜蛋白
NCBI:国家生物技术信息中心
N蛋白:核衣壳蛋白
pI:等电点
蛋白质:峰值蛋白质
TN:真正的负
TP:真阳性


A Mavragani编辑;提交01.01.22;S Rostam Niakan Kalhori, A Banerjee的同行评议;对作者27.04.22的评论;修订版收到16.05.22;接受04.07.22;发表19.07.22

版权

©Fatemeh Ghafouri, Reza Ahangari Cohan, Hilda Samimi, Ali Hosseini Rad S M, Mahmood Naderi, Farshid Noorbakhsh, Vahid Haghpanah。最初发表在JMIR生物信息学和生物技术(https://bioinform.www.mybigtv.com), 19.07.2022。

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