选择SARS-CoV-2高毒株进行硅内分析。SARS-CoV-2的完整基因组可在国家生物技术信息中心数据库中获得，参考文献NC_045512.2。

以下12条SARS-CoV-2病毒蛋白序列从ViPR数据库中检索(宿主:人类，国家:印度)[ 10]: Orf10蛋白(QIA98591.1)、Orf8蛋白(QIA98589.1)、Orf7a蛋白(QIA98588.1)、Orf6蛋白(QIA98587.1)、Orf3a蛋白(QIA98584.1)、膜糖蛋白(QIA98586.1)、包膜蛋白(QIA98585.1)、表面糖蛋白(QIA98583.1)、表面糖蛋白(QHS34546.1)、核衣壳蛋白(QII87776.1)、核衣壳蛋白(QII87775.1)、核衣壳磷蛋白(QIA98590.1)。

ExPASy在线工具ProtParam [ 11]用于预测所选蛋白质序列的各种物理化学性质。

VaxiJen v2.0 [ 12]用于预测所选蛋白质的抗原性。该软件使用氨基酸序列的FASTA文件格式作为输入，然后根据蛋白质的理化性质预测抗原性。输出根据抗原评分[ 13］．在分析过程中，阈值维持在0.4 [ 9］．

通过免疫表位数据库(Immune Epitope Database, IEDB)预测所选表面糖蛋白序列的B细胞和T细胞表位，IEDB数据库包含大量表位和抗体的实验数据[ 14］．IEDB能够在各种工具的背景下对几个表位进行可靠的分析，包括跨抗原的保守性、人群覆盖率和具有相似序列的簇[ 15］．为获得所选表面糖蛋白序列的MHC i类限制性CD8+细胞毒性T淋巴细胞表位，将NetMHCpan EL 4.0预测方法应用于HLA-A*11-01等位基因。采用Sturniolo预测方法获得HLA DRB1*04-01等位基因的MHC ii类限制性CD4+辅助性T淋巴细胞表位。根据它们的百分位分数和抗原性分数，随机选择前10个MHC I类和前10个MHC II类表位。采用bipipedlinear表位预测方法，根据表位长度选择5个B细胞淋巴细胞表位[ 8］．

利用VaxiJen v2.0预测蛋白抗原性。在抗原性分析中，阈值维持在0.4 [ 9］．通过AllerTOP v2预测所选表位的致敏性[ 16］．

使用TMHMM v2.0服务器预测所选表位的跨膜螺旋[ 17]，从而预测表位是在跨膜区域，还是停留在膜内或膜外。所选表位的毒性预测通过毒素pred服务器进行[ 18］．

表位守恒分析通过IEDB服务器的表位守恒分析工具进行[ 15］．在分析过程中，序列同一性阈值保持≥50 [ 8］．

采用MHCcluster 2.0进行聚类分析[ 19， 20.］．在聚类分析过程中，纳入的肽数量保持在5万个，bootstrap计算次数设置为100次。聚类分析采用netmhcpn -2.8预测方法。

PEP-FOLD3在线工具[ 21]用于预测所选最佳表位的3D结构[ 22- 24］．

进行分子对接，描述抑制剂与相应蛋白的结合模式。预对接由UCSF Chimera进行[ 25］．所选表位的肽蛋白对接使用在线对接工具PatchDock [ 26］．FireDock服务器对PatchDock的结果进行了改进和重新记录[ 27］．然后由HPEPDOCK服务器进行对接[ 28］．对接位姿分析使用Ligplot [ 29］．分子模拟使用GROMACS 2018.1包，使用Gromos43a1力场[ 9］．用SPC水模型在10.8 × 10.8 × 10.8 nm的立方箱中进行蛋白质溶剂化^3.)．使用最陡算法对溶剂化蛋白系统进行能量最小化处理，最多可达25,000步，或直到最大力不大于缺省阈值1000 kJ/mol/nm。NVT和NPT集成在300k和1atm下运行5万步(100 ps)。系统首先用NVT系综平衡，然后用NPT系综平衡。最后对与HLA-A*11-01等位基因对接的GVYFASTEK表位复合物(Protein Data Bank [PDB] ID 5WJL)进行分子动力学模拟。最后，根据模拟全集原子位置的均方根偏差(RMSD)和均方根波动(RMSF)对模拟进行评价。除了最终的分子动力学模拟进行了50 ns外，所有模拟步骤都相似。

确定了SARS-CoV-2毒株，并从ViPR数据库中检索了针对印度人类宿主的12个病毒蛋白序列，并选择用于可能的候选疫苗鉴定( 表1)．文中给出了蛋白质的FASTA序列 多媒体附件1．

分析了12种蛋白质的理化性质，包括氨基酸、分子量、理论等电点(pI)、消光系数(M^－1厘米^－1)、估计的半衰期(在哺乳动物细胞中)、不稳定性指数、脂肪指数和亲水性总平均(GRAVY)进行预测( 表2)．在0.4的固定阈值下，预测所有蛋白质都具有抗原性( 表3)．理化分析表明，表面糖蛋白(QIA98583.1)的消光系数最高，为148,960 M^－1厘米^－1各蛋白中GRAVY值最低，为-0.077。此外，表面糖蛋白稳定，具有抗原性;因此，我们选择该蛋白进行进一步分析。

采用IEDB服务器的NetMHCpan EL 4.0预测方法确定MHC I类T细胞表位，序列长度设置为9。根据抗原性评分和百分位评分进一步分析服务器生成的表位，随机选择前10位的潜在表位进行抗原性、致敏性、毒性和保护性测试。服务器将预测的表位按百分比分数升序排列( 表4)．该蛋白的MHC II类(HLA-DRB1*04-01等位基因)的T细胞表位也通过IEDB服务器( 表5)采用Sturniolo预测方法。随机选取该蛋白排名前10位的表位进行进一步分析。此外，使用IEDB服务器的bipiered线性表位预测方法选择蛋白质的B细胞表位，表位的选择基于更大的长度( 图2)．

所选表位的拓扑由TMHMM v2.0服务器确定。 表4而且 表5代表所选表面糖蛋白的潜在t细胞表位。 表6显示了具有各自拓扑结构的潜在B细胞表位。

所选T细胞表位具有高抗原性、非致敏性、无毒性，保护率大于90%。在10个选择的MHC I类表位和10个选择的MHC II类表位中，根据上述标准共选择了4个表位:GVYFASTEK、TLADAGFIK、NFRVQPTESI和LLIVNNATNV。

可能与预测表位相互作用的MHC I类等位基因的聚类分析是通过在线工具MHCcluster 2.0进行的，该工具生成了等位基因的系统进化集群。结果显示在 图3，其中红色区域表示强相互作用，黄色区域对应弱相互作用。

使用PEP-FOLD3服务器对所有T细胞表位进行三维结构预测，用于肽蛋白对接( 图4)．

进行分子对接，以确定所有鉴定的表位是否都能与MHC I类和MHC II类分子结合。所选表位与HLA-A*11-01等位基因(PDB ID 5WJL)和HLA-DRB1*04-01等位基因(PDB ID 5JLZ)对接。对接使用PatchDock在线对接工具完成，并由FireDock在线服务器进行细化。HPEPDOCK服务器还对结果进行了分析(见中图S1) 多媒体附件1)．在4个表位中，筛选出的糖蛋白QIA98583.1、GVYFASTEK (MHC类I表位)表现最好，整体能量最低，为-52.82。进一步，通过Ligplot分析对接姿态( 图5A)和对接地点可以可视化 图5b.我们还从所选的表面糖蛋白(QIA98583.1)中鉴定出高抗原性和非致敏性b细胞疫苗候选LTPGDSSSGWTAG和VRQIAPGQTGKIAD。

GVYFASTEK表位与HLA-A*11-01等位基因(PDB ID 5WJL)的对接复合物的分子动力学模拟成功执行了50 ns。在整个模拟过程中，配合物趋于稳定，RMSD从初始位置波动0.3 ~ 1.0 nm ( 图6a).在大多数情况下，位于核心蛋白区域的残基RMSF值较低，而暴露环的RMSF值较高( 图6b).图中的峰值在0.1 ~ 0.6 nm之间。这两个结果都表明，在整个分子对接模拟过程中，蛋白配合物是稳定的，说明蛋白具有良好的稳定能力。

疫苗是一种非常必要和广泛形成的治疗产品。每年有数百万婴儿、儿童和成人接种疫苗。然而，疫苗的开发和研究过程是昂贵的，有时需要无数个月的时间来准备和推进一种合适的候选疫苗，以消除病原体。目前有无数的免疫信息学、计算机辅助药物设计、生物信息学和正/反疫苗学等工具和方法，广泛推进疫苗的设计和制备，从而有助于缩短疫苗扩展的持续时间和成本投资[ 8， 30.］．

本研究通过理化分析发现，SARS-CoV-2表面糖蛋白QIA98583.1的消光系数最高，为148,960 M^－1厘米^－1在所鉴定的病毒蛋白中，GRAVY值最低，为-0.077。此外，所选表面糖蛋白具有较高的稳定性(不稳定性指数<40)和抗原性。蛋白的抗原性由VaxiJen V2.0服务器检测。如果一种化合物的可变性指数大于40，就意味着该产物被认为是不平衡的[ 31］．消光系数是指复合物在特定波长捕获的光量[ 32， 33］．各种物理化学性质，包括氨基酸数量，分子质量/质量，理论pI，消光系数，不确定性指数，脂肪族指数，肉卤，通过ProtParam服务器解析[ 34］．

两种主要的免疫细胞是B淋巴细胞和T淋巴细胞，它们在人体中起着防御作用。一旦被抗原提呈细胞(APC;例如，树突状细胞和巨噬细胞)，抗原可被存在于apc表面的MHC II类分子接触到辅助T细胞。随后，辅助T细胞在其表面获得CD4+片段，称为CD4+ T细胞。一旦被APC刺激，辅助T细胞随后刺激B细胞，产生产生抗体的浆B细胞和记忆B细胞。血浆B细胞收集多种抗体，记忆B细胞在长期免疫记忆中发挥作用。此外，巨噬细胞和CD8+细胞毒性T细胞也被辅助性T细胞触发，最终消灭靶抗原[ 35- 39］．

所选SARS-CoV-2病毒蛋白可能的B细胞和T细胞表位由IEDB服务器识别[ 14]，该系统根据抗原表位的抗原性分数和百分位分数生成并对其进行排序。前10位的MHC I类和II类表位参与了这项调查。精确表位的拓扑由TMHMM v2.0服务器解析[ 17］．在所有炎症情况下，如致敏性、抗原性、毒性和保护性检查，发现T细胞表位具有极高的抗原性，具有较高的免疫反应，无致敏性或毒性，并显示保护性超过90%。在该蛋白的10个特定MHC I类和10个选定的MHC II类表位中，根据揭示的特性指定了4个表位，GVYFASTEK、TLADAGFIK、NFRVQPTESI和LLIVNNATNVV，以及被选择用于额外候选疫苗调查的抗原性和非致敏性B细胞表位。对可能与预测表位相互作用的MHC I类和MHC II类等位基因的聚类检测是通过在线工具MHC聚类2.0进行的[ 20.］．抗原性被界定为一种外来成分作为抗原并刺激B细胞和T细胞对其表位作出反应的能力，相应地确定了抗原决定部分[ 40］．致敏性被定义为该成分作为过敏原并在宿主体内诱发潜在过敏反应的能力[ 41］．

此外，对MHC I类和II类等位基因进行类似的聚类分析，以对它们之间的关联进行分类，并根据它们的功能和预测的特异性对它们进行分组[ 19］．在接下来的步骤中，将所选表位与MHC等位基因进行肽蛋白对接。MHC I类表位与MHC I类分子(PDB ID 5WJL)保持对接，MHC II类表位与MHC II类分子(PDB ID 5JLZ)相应对接。进行肽蛋白对接，以评估表位与MHC分子相互作用的能力。通过UCSF Chimera进行预对接，然后对表位进行3D结构生成。对接由PatchDock和FireDock服务器执行，并由基于全局能量构建的HPEPDOCK服务器进行分析。GVYFASTEK表位在肽蛋白对接中得分最高。所有候选疫苗都被证明具有潜在的抗原性和非致敏性，这表明它们不应该在宿主内引起任何致敏性反应。然而，应该进行更多的体外和体内检查，以确认预测的候选疫苗的安全性、有用性和潜力。

面对COVID-19大流行造成的痛苦、死亡和社会困境的巨大悲剧，开发有效和安全的疫苗至关重要。生物信息学、反疫苗学和相关技术被广泛应用于疫苗设计和开发，因为这些技术可以减少成本和时间。在这项研究中，我们首先从印度的菌株中鉴定出属于SARS-CoV-2对抗人类宿主的蛋白质。然后通过稳健的过程确定了能够有效引发与这些选定蛋白质相关的细胞介导免疫反应的潜在B细胞和T细胞表位。潜在的T细胞表位(GVYFASTEK)和B细胞表位(LTPGDSSSGWTAG, VRQIAPGQTGKIAD, QIAPGQTGKIAD和ILPDPSKPSKRS)可以在新的亚单位和多表位疫苗的开发中发挥重要作用。总之，反向疫苗学被证实是一种识别新型候选疫苗及其后续应用的可靠手段。这项研究可以激励进一步研究，朝着创新和高效的方向发展，为寻找由SARS-CoV-2引起的COVID-19的有效及时治疗提供快速、可靠和重要的平台。