我们从共享所有流感数据全球倡议(GISaid)知识库中获得了数据，并对截至2020年5月5日(2020年5月5日)其中可用的所有基因组进行了采样，包括文件刚果-gisaid_hcov-19_2020_05_05_09。Fasta, 75项，意大利-gisaid_hcov-19_2020_05_05_10。Fasta, 69项，瑞典-gisaid_hcov-19_2020_05_05_10。Fasta包含104个条目，以及外组文件brazil_gisaid_hcov-19_2020_05_15_04。Fasta有92个条目。从GenBank存储库下载了登录号为NC_045512.2的参考基因组。

我们使用了SARS-CoV-2武汉-胡-1基因组(RefSeq Acc。不。NC_045512.2)作为参考序列和VIRULIGN版本1.0.1应用程序[ 10]进行多序列比对，并使用AliView 1.26版本应用程序将分析结果可视化[ 11］．采用HyPhy 2.5.8 (MP)，采用遗传算法重组检测方法进行重组分析，并进行修剪、停止密码子去除、进化树和进化混合效应模型(MEME)分析[ 12］．MEME网站用于读取JSON输出文件并生成MEME图像和表格。

我们使用RNA_fold网络服务器(维也纳RNA网络套件的一部分)来预测野生型和突变序列的二级结构[ 13]，以及Forna包[ 14]来建立图表。

蛋白紊乱分析采用MFDp2 [ 15]， NetSurfP-2.0 [ 16]和SPOT-Disorder2 [ 17)应用程序。使用TMHMM server v.2.0, MemBrain webserver计算蛋白质的跨膜分析[ 18]， ProtScale [ 19]，和TMpred [ 20.Expasy网站上的分数(用于比较)[ 21］．

通过使用Robetta webserver，用从头算方法确定了这两种蛋白质结构[ 22]，而来自OCEAN CODE的DeeProtein胶囊[ 23]用于预测所预测蛋白质的本体。使用PyMOL 2.4.0发布蛋白质结构及其本体的3D图像[ 24］．

基于MEME算法对来自意大利、瑞典、刚果(位于同一地理子午线的国家)和巴西(作为外组)的SARS-CoV-2数据进行了混合进化分析。调查显示，密码子9628在各个国家都处于周期性的正选择压力下，如图所示 表1．

在这种情况下，我们使用术语“站点”作为密码子的同义词，尊重HyPhy术语。渐近 P值为<。001for episodic diversification at site 9628. 图1的分布 P所有4个国家的网站价值。

深入检查4个国家的多重比对数据，发现9628位点的偶发正选择压力是密码子GGG向ACG的一致性突变，如图 图2．

突变前后二级结构的预测存在重要差异，从GGG突变到ACG ( 图3)．两种预测的二级结构之间的比较突出了RNA构象右上方环的结构修饰，如图所示 图4表明GGG到ACG的突变导致了RNA二级结构的显著改变。

对该蛋白质进行的无序区分析结果显示，从41到59的位置更为稳定，甘氨酸(G)位于第50位。我们通过使用3种不同的软件工具，并考虑无序概率的平均值得到结果，如图所示 图5并在 表2．对蛋白质跨膜区域的进一步分析显示，54-67位点与该功能相关。该分析通过使用4个不同的web应用程序进行，并通过评估所得的平均值，将甘氨酸(G)放置在跨膜区域附近，以假设其参与。 表3报告数据显示每个氨基酸作为跨膜的概率。序列的跨膜拓扑( 图6)突出显示了跨膜区域中间位置50的氨基酸G，以及概率( 图7)证实了这一假设。

为了表征推导出的蛋白P0DTD3.1，我们使用从头算方法预测了野生型和突变蛋白序列的3D结构。根据二级结构预测的初步线索，当氨基酸残基由G变为T时，突变蛋白的结构略有不同。 图8而且 9说明两个预测模型，表明突变将影响蛋白质的三级结构。MUT31136和MOD30336之间残基45-55的比较表明，突变蛋白的这部分延伸到前面的螺旋。这一结果表明，单个氨基酸从G突变到T，在蛋白质的三维结构上进行连续的拉伸循环，容易使蛋白质承担新的功能。

蛋白质本体论分析表明，野生型和突变型蛋白质由于结构的改变而具有不同的功能。如 表4时，该蛋白的野生型变异以高概率(.978≤ P催化和转移酶活性均≤1)。该蛋白的突变变体在其功能趋势上呈现出显著变化:即使通常低于0.5的分数被解释为负面预测，在进化的背景下，转移酶活性(从0.98到0.375)有利于结合功能(从0.004到0.132)的概率下降也不可忽略。转移酶与结合活性倾向的上下文反转表明，这种偶发性进化突变旨在提高蛋白质的结合能力。

sars - cov -2是已知导致COVID-19大流行的病毒，与其他冠状病毒相比，它有许多独特的特征，例如快速积累突变[ 25］．具体而言，单核苷酸转变作为sars - cov -2的主要突变类型在世界范围内的流行已经在以前得到了证明[ 7］．在本研究中，我们对突变进行了进化分析，以确定同一经络上来自不同国家的SARS-CoV-2基因组是否存在特定的变异模式。我们发现密码子9628在同一子午线上的4个国家都处于幕式选择压力下。这将影响RNA二级结构，从而影响蛋白质产物，T(苏氨酸)在蛋白质第50位转变为G(甘氨酸)。这个位置靠近预测的跨膜区域。突变分析表明，从G(甘氨酸)到D(天冬氨酸)的变化可能赋予该蛋白一种新的功能，即结合活性，这反过来可能是将病毒附着在人类真核细胞上的原因。这些生物信息学发现可能有助于更好地设计体外(湿实验室)和体内(动物模型)实验，以确定与病毒毒力相关的蛋白质变异。因此，这些发现可能最终有助于疫苗设计和成功的抗病毒策略。例如，本研究的结果表明需要进行位点定向诱变和动物实验来验证预期的效果。

Mercatelli和Georgi [ 7]证明了流行于欧洲的分支G在刺突蛋白中携带D614G突变，该突变负责病毒与宿主人类细胞的初始相互作用。其他研究也表明，从不同大陆分离出来的菌株存在不同的突变位点。2891、3036、14408、23403和28881位点的突变主要出现在欧洲毒株中，而17746、17857和18060位点的突变仅出现在北美毒株中[ 26］．他们的发现表明，该病毒正在进化，欧洲、北美和亚洲的病毒株可能共存，每种病毒株都具有不同的突变模式。

此外，对来自13个国家的SARS-CoV-2毒株的病毒基因组进行了比较，发现了蛋白质编码序列的差异。例如，印度菌株在R408I位点的刺突糖蛋白和I671T、P2144S和A2798V位点的复制酶多蛋白出现突变，而西班牙和韩国菌株的刺突蛋白分别出现F797C和S221W突变[ 27］．此外，最近对来自不同地理位置的SARS-CoV-2毒株的基因组进行的综合分析揭示了可能对宿主-病毒相互作用和发病机制产生影响的独特特征[ 28］．然而，最近对30983个SARS-CoV-2基因组的基因组多样性和热点突变的研究表明，与流感病毒或艾滋病毒不同，SARS-CoV-2的突变率很低，这使得开发有效的全球疫苗很有可能[ 29］．该研究确定了整个SARS-CoV-2基因组中的几个热点突变。总共在病毒基因组的不同位置鉴定出14个非同义热点突变(其突变流行率为>10%):8个在ORF1ab多蛋白(nsp2、nsp3、跨膜结构域、RdRp、解旋酶、外切酶和核糖核酸内酶中)，3个在核衣壳蛋白中，3个在3个蛋白刺突ORF3a和ORF8中各1个。此外，在刺突蛋白的受体结合区域发现了36个非同义突变，在所有基因组中流行率较低(<1%)[ 29］．

这些发现凸显了研究新冠病毒分离株地理位置与基因组突变的关系的重要性，因为这种关系也可以通过系统发育树分析来确定，从而根据地理位置来阐明谱系和聚类。综上所述，该基因组进化分析揭示了密码子9628对从同一地理经线的所有4个国家(意大利、瑞典、刚果和巴西)分离的SARS-CoV-2毒株处于幕式选择压力下。