大多数公开的SARS-CoV-2基因组序列被存入以下数据库: 多媒体附件2列出GISAID贡献者)，NCBI, ENA和CNGB。所有数据库都提供批量下载数据的选项。我们使用硒[ 7]以自动下载资料。

我们收集了来自GISAID、NCBI、ENA和CNGB的SARS-CoV-2序列。许多序列代表了不完整的基因组，有时只包含一个基因。我们使用25000个核苷酸的简单截断来过滤这些基因组，因为这样做可以在保留完整基因组的同时去除明显不完整的基因组(图1) 多媒体附件1)．NCBI和ENA都是国际核苷酸序列数据库合作组织(INSDC)的一部分，因此包含重复提交，我们通过比较登录id删除了这些重复提交。此外，双重提交可以在GISAID和INSDC中以不同的登录id出现。如果两份提交的基因序列相同，我们将其视为可疑的重复。这些可疑的重复被标记在元数据中，但没有被删除，因为一个菌株可以感染多个患者。

我们使用快速傅里叶变换(MAFFT)的多重比对对参考序列(NCBI接入ID: NC_045512.2)进行了成对比对[ 8使用默认选项。

我们使用自定义Python脚本进行变体调用，其中考虑了单核苷酸多态性(SNPs)、插入和删除。我们使用bcftools左归一化每个变量[ 9]并删除了含有太多变体的样本，这表明测序错误。我们使用了350个变异的宽限，因为这样做删除了具有大量变异的样本，同时保留了大多数样本(图2) 多媒体附件1)．在后处理过程中，我们删除了多等位基因位点，因为这些位点更有可能出现在易于测序错误的区域，例如基因组的两端(图3) 多媒体附件1)．此外，我们删除了poly-A尾部中的变体。被过滤的变体调用集被snpEff注释[ 10］．

为了检测ORF边界，我们采用了类似于病毒注释管道和识别(VAPiD)的方法[ 11］．由于NCBI Genbank为SARS-CoV-2参考基因组提供了遗传注释，我们使用成对比对将ORF边界坐标从参考基因组翻译为查询基因组。对于多段orf(即由于核糖体滑移)，我们对每个片段进行独立注释，然后将其合并。

CoV-Seq web服务器托管在Amazon web Services (AWS) Elastic Beanstalk上，启用了负载均衡器，与Flask框架一起运行[ 12]，锦佳模板引擎[ 13]，和Werkzeug [ 14Web服务器网关接口(WSGI)工具包。用户通过文本框(对于单个序列)或文件上传(对于任意数量的序列)提交数据后，后端程序将执行成对序列对齐、变量调用和ORF边界检测，以生成VCF和JSON格式的结果。前端模板将使用JSON数据在新页面上呈现基因组序列，ECharts [ 15]库，以及专门设计的JavaScript函数。结果页面根据参考序列突出显示所提交序列的突变，并在光标悬停时显示详细信息。用户还可以放大查看基因组序列的细节。选择一个特定的ORF将展开显示，以显示突变表、ORF表和所选ORF的基因序列。

随着时间的推移，提交给GISAID、NCBI、ENA和CNGB的SARS-CoV-2序列数量不断增加。 图1按收集日期显示序列的累积数量。来自亚洲的序列自1月份以来稳步增长，而来自其他大陆的序列最初增长缓慢，但在3月份出现了急剧增长。提交的数量反映了该病毒的全球传播情况，从1月在中国的首次暴发开始，到随后3月的全球暴发。请注意，虽然个案数目与整体个案数目有关，但个案数目并不反映实际个案数目( 图2)．提交数量最多的10个国家包括5个欧洲国家(英国、西班牙、葡萄牙、荷兰和瑞士)、2个亚洲国家(印度和中国)、2个北美国家(美国和加拿大)和1个大洋洲国家(澳大利亚)。

CoV-Seq提供直观的web界面( 图3A)用于分析和可视化SARS-CoV-2变体和orf。在收到自定义序列后，CoV-Seq识别ORF边界和遗传变异，并将其与全长基因组一起显示( 图3B).用户通过拖动缩放条调整放大倍率，拖动位置条沿基因组移动与基因组交互。当基因组窗口包含少于150个核苷酸时，字母将同时显示核苷酸碱基和氨基酸残基。将鼠标悬停在ORF主体或变体上将触发弹出窗口以显示相关信息( 图3B，红框)。单击一个ORF会弹出三个表。第一个表显示了所有变体及其位置、等位基因和它们所属的orf ( 图3C).第二个表显示了通过将输入序列与参考序列对齐并从Genbank ( 图3D).第三个表显示了所选ORF(未显示)的核苷酸和蛋白质序列。可以下载所有表格进行进一步分析。

由于SARS-CoV-2基因组序列的快速积累，对于大量收集来说，点击式网页界面非常耗时。因此，我们提供了一个命令行界面(CLI)，用于高通量的序列批处理[ 16］．CLI允许用户用一个命令从多个序列中识别变量和ORF边界。此外，CLI允许用户用一个命令从FASTA文件的多个序列中识别变体。

为了方便利用公开数据进行下游分析，我们汇总了来自GISAID、NCBI、ENA和CNGB的SARS-CoV-2基因组序列;我们还鉴定和注释了遗传变异。此外，我们将元数据与每个序列的位置和收集日期等关键信息聚合在一起(参见方法)。所有汇总信息可从CoV-Seq web服务器下载[ 17］．基于这组信息，我们提供了关于序列提交的地理和时间分布的统计数据，并鼓励其他科学家进一步分析。

在本文中，我们描述了CoV-Seq，一个能够快速分析SARS-CoV-2基因组序列的web服务器。CoV-Seq由几个组件组成。交互式可视化模块接受自定义序列作为输入，并在交互式基因组浏览器上显示遗传变异和ORF边界。对于批处理需求，CoV-Seq提供了一个CLI界面，可以一次处理多个序列。为了鼓励使用公开数据进行下游分析，CoV-Seq提供了包含序列元数据和基因突变的可下载分析结果(每周更新)。

CoV-Seq目前仅限于SARS-CoV-2序列。web服务器不允许自定义除SARS-CoV-2以外的参考序列。我们之所以将重点放在这种病毒上，是因为在COVID-19大流行期间，它构成了处理请求的大部分。我们计划在未来的版本中提供额外的功能来接受自定义引用序列。

现有软件包VAPiD [ 11]和病毒基因组ORF读取器(VIGOR) [ 18]专注于基因注释。据我们所知，以前没有人创建过识别、注释和可视化SARS-CoV-2基因变异的软件包。

我们开发了CoV-Seq web服务器，用于快速、简便地分析SARS-CoV-2序列。我们希望CoV-Seq将有助于提高我们对COVID-19基因的理解。未来，我们计划将CoV-Seq的范围扩大到包括其他病毒。